Transfer jądrowy, transplantacja jąder komórkowych () – technika używana w genetyce polegająca na przeniesieniu jądra komórki (dawcy) do oocytu uprzednio pozbawionego własnego jądra komórkowego (biorcy). Tak powstały zrekonstruowany zarodek uzyskuje potencjał do wytworzenia wszystkich typów komórek dorosłego organizmu.

W szerokim znaczeniu transfer jądrowy polega na przeniesieniu jądra komórkowego (a wraz z nim materiału genetycznego) z jednej komórki do drugiej, której własne jądro zostało usunięte lub dezaktywowane. Pod wpływem czynników zawartych w cytoplazmie komórki biorcy następuje zmiana ekspresji genów w jądrze komórki dawcy w związku z reprogramowaniem.

Technika transferu jądrowego stosowana jest do uzyskania klonów zwierząt, otrzymywania zwierząt transgenicznych, pozwala na wytwarzanie embrionalnych komórek macierzystych specyficznych dla danego pacjenta do zastosowania w medycynie regeneracyjnej, a ponadto daje możliwość zbadania komórkowych i molekularnych aspektów reprogramowania jądrowego.

Opis techniki Charakterystyka 350px|thumb|Schemat klonowania

Transfer jądrowy polega na przeniesieniu jądra z całym jego materiałem genetycznym pochodzącego z jednej komórki do innej komórki (oocytu). Jądro używane w tej procedurze może pochodzić z niezróżnicowanej komórki embrionalnej lub dojrzałej, zróżnicowanej komórki (komórki somatycznej) – w tym drugim wypadku technika ta nazywana jest transferem jądrowym komórki somatycznej (SCNT – ). Wykorzystanie zarodkowych komórek macierzystych daje na ogół większe prawdopodobieństwo prawidłowego rozwoju zrekonstruowanego embrionu po transferze jądrowym. Jeśli używa się komórek somatycznych, różne rodzaje komórek mogą istotnie różnić się pod względem szans na powodzenie techniki.

Dojrzałe, zróżnicowane komórki zachowują całość informacji genetycznej pozwalającej potencjalnie na odtworzenie całego organizmu. Informacje te zawarte w DNA nie ulegają utracie podczas rozwoju komórki, zatem nie genetyczne, a epigenetyczne mechanizmy (niezwiązane ze zmianą sekwencji nukleotydów w DNA) utrzymują komórkę w stanie zróżnicowanym. Aby zmienić stan komórki na mniej zróżnicowany, na podobieństwo pluripotencjalnego embrionu, musi zajść reprogramowanie epigenetyczne cofające modyfikacje epigenetyczne wprowadzone podczas rozwoju komórki i jej różnicowania. Takie całkowite reprogramowanie może być zainicjowane podczas transferu jądrowego.

Technika transferu jądrowego jest kosztowna, pracochłonna i wymaga doświadczenia w mikromanipulacji. Jednocześnie jest mało wydajna – typowo około 20% sklonowanych embrionów daje użyteczne linie zarodkowych komórek macierzystych i tylko 1–5% sklonowanych embrionów wszczepionych matkom zastępczym rozwija się, dając żywotne i zdrowe potomstwo. W analizie przyczyn niskiej wydajności trudne do rozdzielenia są powody biologiczne i techniczne. Jedną z najważniejszych jest niekompletne lub nieprawidłowe reprogramowanie, co wiąże się z nieprawidłową ekspresją genów, zaburzeniami rozwojowymi na etapie przed implantacją, po implantacji, a nawet po urodzeniu.

Etapy Transfer jądrowy jest to skomplikowana, wieloetapowa technika składająca się z dojrzewania oocytów pod wpływem hormonów, pozbawiania ich jądra, przeniesienia do nich jądra komórkowego, aktywacji i kultury zarodków. Najczęściej stosowaną metodą usuwania jądra z komórki jest użycie mikromanipulatorów. Jedną pipetką komórka jest przytrzymywana, a druga jest wprowadzana do komórki i pobiera chromatynę. Komórki dawcy są hodowane i doprowadzane do odpowiedniej fazy cyklu komórkowego. Wprowadzenie jądra do komórki biorcy odbywa się poprzez mikroiniekcję lub fuzję membran. Metoda fuzji jest łatwiejsza i zdecydowanie bardziej rozpowszechniona. Wykorzystuje się w tym celu fuzjogenne właściwości cząstek wirusowych (wirus Sendai) lub impulsy elektryczne (tzw. elektrofuzja). Elektrofuzja jest metodą łatwiejszą i częściej stosowaną; powoduje ona elektroporację. Kiedy materiał genetyczny wniknie do oocytu, powstały w ten sposób zrekonstruowany embrion możne być aktywowany, aby rozpocząć jego podziały w kulturach .

W naturze aktywacja rozwoju zarodkowego następuje, gdy wewnątrzkomórkowe oscylacje stężenia jonów osiągną pewien poziom. Odbywa się to w wyniku zapłodnienia. Istnieją jednak sztuczne metody aktywacji rozwoju do zastosowania w warunkach laboratoryjnych wobec zrekonstruowanych embrionów jak zastosowanie impulsów elektrycznych, etanolu, jonomycyny, kalcymycyny, strontu, tiomersalu.

Jeśli celem jest klonowanie reprodukcyjne lub otrzymanie genetycznie modyfikowanego zwierzęcia, embrion, który osiągnął stadium blastocysty jest wszczepiany matce zastępczej, aby doniosła ciążę. Prowadzenie kultur zrekonstruowanych embrionów przed tym etapem pozwala wyselekcjonować te rozwijające się prawidłowo. Zrekonstruowane zarodki mogą wykazywać inny metabolizm i wymagania względem warunków prowadzenia kultur w porównaniu z normalnymi embrionami. Matka zastępcza poddawana jest odpowiedniej terapii hormonalnej, aby zsynchronizować fazę cyklu rozrodczego z etapem rozwoju zarodka. W dniu wszczepienia zwierzę matka powinno być w rui. Przebieg takiej ciąży, jak również zwierzęta w okresie tuż po urodzeniu, zwłaszcza w przypadku zwierząt gospodarskich, są monitorowane przez lekarza weterynarii. Sklonowane zwierzęta mogą bowiem cierpieć na różne schorzenia wynikające z błędów epigenetycznych, spośród których najczęściej występują problemy z układem oddechowym. W przypadku zwierząt gospodarskich może mieć to mniejsze znaczenie, ponieważ potomstwo sklonowanych zwierząt nie wykazuje już nieprawidłowości wynikających z błędów epigenetycznych.

Historia Koncepcja transferu jądrowego została opracowana w 1928 przez niemieckiego embriologa Hansa Spemanna, który eksperymentował z przenoszeniem jąder komórek embrionalnych salamandry do komórek jajowych. W 1952 Robert Briggs i Thomas Joseph King opracowali technikę transplantacji jądrowej. Udało im się przenieść jądra z blastomerów (w stadium blastuli) żaby do oocytów pozbawionych własnego jądra, co doprowadziło do powstania normalnych embrionów. Było to pierwsze udane przeszczepienie jądra w przypadku organizmów wielokomórkowych i dowód, że jądra mogą być przeprogramowane, by wrócić do stanu zygotycznego. Później jednak odkryli, że im późniejszy etap rozwoju i bardziej zróżnicowana komórka z jądrem wykorzystywana jako dawca, tym mniejsza jest efektywność w tworzeniu embrionów (klonów).

Pod koniec lat 50. i na początku lat 60. John Gurdon przeniósł u żaby jądro pobrane z komórki nabłonka jelita do komórki oocytu bez własnego jądra. Z jaja rozwinęła się zdrowa kijanka. W ten sposób zostało udowodnione, że podczas różnicowania się komórek nie następuje utrata genów, tylko zmienia się ich ekspresja, a ponadto że jądra zróżnicowanych komórek zachowują swoją totipotencję.

Pierwsze próby sklonowania ssaka miały miejsce w 1975. Zastosowano mikroiniekcję oraz fuzję komórek moruli indukowanej wirusem z niezapłonionymi komórkami jajowymi królika. W obu przypadkach bruzdkowanie kończyło się na wczesnych etapach. Pierwsze ssacze klony uzyskano w 1986 w wyniku przeniesienia jąder z blastomeru (w stadium embrionu złożonego z 8 lub 16 komórek) owcy do pozbawionych własnych jąder oocytów. W podobny sposób sklonowano w 1987 krowę, w 1988 królika i 1989 świnię. W 1997 Keith Campbell, Ian Wilmut i współpracownicy ogłosili narodziny owcy Dolly – pierwszego ssaka sklonowanego z dojrzałej komórki somatycznej pobranej z gruczołu mlekowego dorosłego osobnika.

Od czasu Dolly dokonano znaczącego postępu w technologii klonowania i poznaniu wymagań dla danego gatunku. Powstało wiele klonów innych zwierząt z wykorzystaniem jako dawcy zarówno komórek embrionalnych, jak i dojrzałych, zróżnicowanych. Mimo to nadal nieznane są dokładne mechanizmy tych procesów, a efektywność metody wciąż pozostaje bardzo niska. Przykładowo w przypadku owcy Dolly przeprowadzono 277 transferów jądrowych i fuzji, z czego rozwinęło się 29 zarodków wszczepionych 13 matkom zastępczym i tylko jedna ciąża zakończyła się udanym rozwiązaniem.

Klonowanie zwierząt Klonowanie ma na celu otrzymanie genetycznie identycznych kopii materiału biologicznego jak geny, komórki, tkanki lub całe organizmy. W naturze w świecie roślin i zwierząt klony powstają w wyniku rozmnażania bezpłciowego. Taki typ rozmnażania nie występuje naturalnie u ssaków, ale występują genetycznie identyczne organizmy – bliźnięta jednojajowe.

Kwestię identyczności genetycznej komplikują mitochondria – półautonomiczne organella posiadające własny, mitochondrialny DNA. Poza pewnymi wyjątkami dziedziczone są po matce. W przypadku techniki SCNT zaobserwowano u powstałych embrionów zarówno homoplazmię (źródłem wszystkich mtDNA zarodka jest oocyt), jak i heteroplazmię (źródłem mtDNA zarodka jest zarówno oocyt, jak i komórka somatyczna). W przypadku iSCNT zwykle zachodzi heteroplazmia. W związku z tym, że powstałe w ten sposób zwierzę nie będzie miało identycznego mtDNA jak zwierzę, od którego pobrano komórkę somatyczną, to ściśle rzecz biorąc są identyczne genetycznie tylko pod względem DNA jądrowego. Tymczasem bliźnięta jednojajowe mają identyczny cały DNA, również mitochondrialny.

Klonowanie mające na celu uzyskanie kopii (pod względem genetycznym) pierwotnego organizmu nazywane bywa klonowaniem reprodukcyjnym. Klonowanie embrionów mające na celu pozyskanie tkanek identycznych względem dawcy w celu badań lub potencjalnie w celu leczenia chorób określa się klonowaniem terapeutycznym. W tym wypadku zrekonstruowanego embrionu nigdy nie wszczepia się do organizmu matki zastępczej.

Sklonowanie owcy Dolly udowodniło, że możliwe jest u ssaków cofnięcie dojrzałych, zróżnicowanych komórek somatycznych do stanu totipotencji. Wcześniej przypuszczano, że taka odwracalność procesu różnicowania komórek może być możliwa tylko u niższych kręgowców, nie ssaków. Mimo upływu czasu efektywność procesu klonowania zwierząt nadal pozostaje niska, co jest wynikiem niskiej efektywności reprogramowania jądra komórek somatycznych przez cytoplazmę oocytu. Nadal nieznane są dokładne mechanizmy tych procesów, ale kluczowe są zmiany w ekspresji określonych genów warunkujących pluripotencję (np. Oct-4, Nanog).

Często sugeruje się, że klon przy urodzeniu ma pod względem biologicznym taki wiek jak zwierzę dawca, od którego pobrana została komórka somatyczna użyta w SCNT. Pogląd ten pojawił się po badaniach ukazujących, że owca Dolly i inne sklonowane owce mają krótsze telomery niż inne owce w podobnym wieku i przekonanie to dodatkowo wzmocniło się po przedwczesnej śmierci Dolly. Tymczasem sklonowane bydło domowe i myszy wykazują telomery normalnej długości, co sugeruje że mechanizm odtwarzania telomerów może różnić się między gatunkami. Nie zaobserwowano przedwczesnego starzenia się u klonów powstałych w wyniku SCNT.

Transfer jądrowy w otrzymywaniu zwierząt transgenicznych Transfer jąder komórek somatycznych jest jedną z podstawowych metod otrzymywania zwierząt transgenicznych. Obok mikroiniekcji DNA do przedjądrzy jest najczęściej stosowaną techniką uzyskiwania modyfikacji genetycznych zwierząt domowych. Obie te metody są jednak mało wydajne, czasochłonne i drogie. Transfer jąder pozwala jednak na dokładne wyselekcjonowanie zmodyfikowanych komórek będących źródłem jądra komórkowego dla procesu oraz uniknięcie problemu mozaicyzmu. W przypadku mikroiniekcji transgen jest zwykle wbudowywany w losowe miejsce w genomie, co skutkuje bardzo różnym poziomem jego ekspresji oraz trudnością w pozyskaniu i wyselekcjonowaniu zwierzęcia o optymalnym poziomie tego parametru. Obecnie technika transferu jąder komórek somatycznych jest preferowana zwłaszcza w przypadku stosunkowo dużych zwierząt. Zwierzę rozwijające się ze zrekonstruowanego embrionu po transferze jąder w każdej swojej komórce zawiera transgen. Może on być następnie przekazywany potomstwu zgodnie z prawami Mendla.

Technika iSCNT