Dokowanie molekularne (ang. molecular docking) – metoda komputerowa pozwalająca na predykcję preferowanej pozycji ligandu po związaniu się z makromolekułą (np. białkiem) w jej miejscu wiążącym w celu utworzenia stabilnego kompleksu oraz interpretację występujących interakcji pomiędzy związanym ligandem a makrocząsteczką.
Zastosowanie Dokowanie molekularne jest najpopularniejszą metodą projektowania leków opartą na strukturze (SBDD, ang. structure-based drug design), czyli wtedy gdy znana jest dokładna struktura 3D celu molekularnego. Popularność przyniósł ogromny wzrost mocy obliczeniowej komputerów, który pozwolił na badanie powinowactwa (ang. affinity) wielu ligandów w krótkim czasie.
Głównym celem dokowania molekularnego jest określenie najlepszej pozycji ligandu względem makromolekuły pod kątem strukturalnym, ale również energetycznym. Obliczenia pozwalające na wybranie odpowiedniego ułożenia cząsteczki ligandu opierają się najczęściej o algorytmy komputerowe, które poprzez stopniową modyfikację cząsteczki potrafią dobrać najkorzystniejsze jej ułożenie. Wymienić tu można dla przykładu algorytmy stochastyczne – algorytm genetyczny (GA) oraz algorytm Monte Carlo (MC); czy też algorytm konstrukcji przyrostowej (IC, ang. incremental construction) oparty na fragmentacji ligandu i dokowaniu tych fragmentów do białka. Natomiast dopasowanie energetyczne, czyli przewidywana siła powinowactwa ligandu do białka, oszacowywana jest przy pomocy funkcji punktujących (ang. scoring function). Funkcje te można podzielić na 4 podstawowe typy: funkcje oparte na polach siłowych, funkcje empiryczne, funkcje oparte na wiedzy oraz funkcje oparte na uczeniu maszynowym.
Typy dokowanie molekulanego Wyróżnić można dwa typy dokowania: mała cząsteczka – makrocząsteczka – mała cząsteczka nazywana jest ligandem i najczęściej jest nią substancja endogenna lub egzogenna (np. lek) o małej masie molekularnej. Natomiast makrocząsteczką może być białko (enzym, receptor), peptyd, kwas nukleinowy (DNA, RNA) lub inny biopolimer. makrocząsteczka – makrocząsteczka – tutaj najczęściej dokonuje się dokowania typu białko-białko lub peptyd-białko.
mały|Wykres przedstawiający ogólny zarys metod stosowanych w komputerowym wspomaganiu projektowania leków
Koncept dokowania molekularnego Metoda dokowania molekularnego była już rozpowszechniona w latach 80 XX w. i przyświecał jej cel odkrywania nowych leków in silico,, czyli za pomocą obliczeń komputera, w myśl nurtu racjonalnego projektowania leków. Głównym zadaniem było skrócenie czasu produkcji nowych leków, określania ich powinowactwa oraz zdobycie wiedzy na temat potencjalnych modyfikacji leków w celu poprawy ich działania. Początkowo cały proces wiązania się ligandu z białkiem był traktowany jako struktura sztywna – zarówno ligand, jak i białko nie przybierało różnych konformacji podczas dokowania. Opierał się on na ówczesnym modelu działania enzymów na zasadzie dopasowania klucza do zamka. Wraz ze wzrostem mocy obliczeniowej komputerów zaczęto zastanawiać się nad ulepszeniem tej metody. Nowy koncept działania enzymów opierający się na zasadzie indukowanego dopasowania, traktujący wszystkie procesy zachodzące w organizmie jako procesy dynamiczne, poskutkował modyfikacją metody dokowania. Na początku ligand zaczął przyjmować różne ułożenia w przestrzeni dzięki obrotom cząsteczki wokół wiązań rotujących w celu minimalizacji swojej energii. Następnie również aminokwasy znajdujące się w miejscu wiążącym, odpowiedzialne za interakcje z ligandem, zaczęły przyjmować różne konformacje. Taka metoda dokowania przyjęła nazwę dokowania elastycznego (ang. docking with flexible residue). Pozwoliło to na dokładniejszą estymację powinowactwa ligandu to celu molekularnego.
Etapy dokowania molekularnego Podstawowym etapem jest przygotowanie struktur cząsteczek biorących udział w dokowaniu. Następnym jest określenie miejsca wiążącego ligand, potem wybranie odpowiedniego algorytmu modyfikującego struktury oraz odpowiedniej funkcji punktującej zapewniającej końcowy wynik obliczeń i symulacji. Wszystko to wykonuje się w programach komputerowych służących do dokowania molekularnego. mały|Etapy dokowania molekularnego
Przygotowanie makrocząsteczki, czyli celu molekularnego Celem molekularnym najczęściej będzie białko. Do dokowania molekularnego potrzebna jest jego struktura 3D. Znaleźć ją można w wielu bibliotekach białek, a najpopularniejszą jest PDB (Protein Data Bank). Struktury 3D białek otrzymywane są tam na drodze krystalografii rentgenowskiej lub NMR. Ważnymi parametrami opisującymi te białka są rozdzielczość wykonanej analizy struktury 3D, jak również rodzaj ligandów jakie są związane z danym białkiem, bowiem rodzaj ligandu wiążącego wpływa na ogólną konformację białka co może wpłynąć potem na analizę wyników dokowania molekularnego. Natomiast rozdzielczość jest bardzo ważna przy określaniu dokładności estymacji pozycji ligandu po dokowaniu oraz parametru RMSD (ang. root main square deviation) przy kalibracji i walidacji metody dokowania.
Po odpowiednim wyborze struktury krystalicznej potrzebne jest jej przygotowanie do procesu dokowania. W zależności od tego jaki typ dokowania będzie przeprowadzany, dokonuje się odpowiednich modyfikacji. Przy standardowej procedurze podstawowymi czynnościami jest:
dodanie atomów wodoru do aminokwasów budujących białko – badania krystalografii rentgenowskiej oraz NMR pomijają te atomy i nie są one widoczne w strukturze, dodanie ładunków cząstkowych do poszczególnych aminokwasów – wykorzystywane są tutaj różne metody obliczeniowe np. Kollman lub Gasteiger, naprawienie lub uzupełnienie brakujących atomów w białku, usunięcie cząsteczek wody (inaczej procedura wygląda przy dokowaniu uwodnionym) – woda jest również obecna w strukturze krystalicznej i wykazuje wpływ na dokowanie oraz powinowactwo liganda do celu molekularnego. Jej usunięcie ma na celu zapewnienie większej swobody dopasowania ligandu w miejscu wiążącym, ale również zmniejszenie kosztu obliczeniowego. Niestety prowadzi to do mniej dokładnych oszacowań powinowactwa. W celu dokładniejszych obliczeń stosowane jest dokowanie uwodnione, usunięcie inhibitora związanego z białkiem oraz innych heteroatomów należących często do endogennych substancji – zapewnia to „oczyszczenie” miejsca wiążącego i zapewnienie odpowiedniej przestrzeni do związania się badanego ligandu. Możliwe jest również pozostawienie endogennych cząsteczek w celu zbadania interakcji pomiędzy nimi a badanym ligandem, ustawienie „ruchomych” aminokwasów w białku (procedura wykonywana tylko przy elastycznym dokowaniu) – pozwala to na wyznaczenie konkretnych aminokwasów, które mają rotować przy dokowaniu. Czynność ta zapewnia dokładniejsze wyniki powinowactwa oraz lepszą predykcję ułożenia się ligandu względem aminokwasów w miejscu wiążącym. Należy jednak pamiętać, że im więcej aminokwasów jest „elastycznych” tym więcej czasu zajmuje wykonanie analizy.
Istnieje jeszcze nowsze podejście do zagadnienia przygotowania białka do dokowania. Polega ono na uprzednim przeprowadzeniu symulacji dynamiki molekularnej białka rozpuszczonego w wodzie, a następnie dokonania albo uśrednienia struktury białka podczas całego procesu, albo stworzenia wielu struktur białkowych wyodrębnionych w poszczególnych etapach symulacji dynamiki molekularnej (ang. snapshot) i wyznaczenie z nich struktury uśrednionej poprzez superimpozycjonowanie tych struktur (ensamble structure). Po tych procesach dokonuje się przygotowania białka do dokowania.
Najnowsze odkrycia w dziedzinie uczenia maszynowego zapewniają również możliwość wykonania dokowania bez znajomości początkowej struktury białkowej. Mowa tutaj o programie AlphaFold, który na podstawie samej sekwencji aminokwasowej jest w stanie odtworzyć strukturę trzecio- i czwartorzędową białka ze średnią dokładnością ponad 90% (dokładność zależy w głównej mierze od typu białka i rodziny, z której pochodzi oraz dostępności struktur krystalicznych białek podobnych do niego).
Przygotowanie małej cząsteczki, czyli liganda Przy projektowaniu leków ligandem zawsze jest lek. Leki w większości przypadków są inhibitorami enzymów lub antagonistami receptorów błonowych. Zadokowanie takie ligandu do białka będzie miało na celu zdobycie informacji w jakim stopniu dany lek „nadaje się” do bycia inhibitorem danego celu molekularnego. Wiedzę taką otrzymać można z powinowactwa danego leku do białka wyrażonego energią kompleksu (im mniejsza energia tym mocniej wiąże się dany ligand z białkiem) lub stałej wiązania. W celu zapewnienia rzetelności oraz odpowiedniej dokładności dokowania należy taki ligand przygotować, podobnie jak to miało miejsce z białkiem.
Jednakże pierwszym etapem jest znalezienie struktury liganda. Istnieje wiele bibliotek lub baz danych, w których można znaleźć informacje na temat struktury ligandu. Podstawową bazą danych jest PubChem (biblioteka zawierająca informacje na temat właściwości chemicznych i fizycznych cząsteczek oraz ich struktur 2D i 3D) lub ZINC. Jeśli ligandem jest lek można również korzystać z medycznych baz danych typu DrugBank i in. Po pobraniu odpowiedniej struktury należy ją przygotować pod względem optymalizacji konformacji przestrzennej oraz określić ładunki cząstkowe występujące na poszczególnych atomach. Na konformację przestrzenną wpływają długości wiązań oraz kąty między poszczególnymi atomami w cząsteczce, których wielkość jest dostosowywana do znalezienia lokalnego minimum energetycznego cząsteczki. Do określenia ładunków cząstkowych używane są metody oparte na mechanice kwantowej np. DFT (ang. density functional theory) i podejściu ab initio lub też prostsze i mniej kosztowne czasowo metody oparte na wiedzy lub zestawie parametrów dla wybranych atomów lub ugrupowań. Ważną kwestią jest również odpowiednie uprotonowanie ligandu oraz dodanie brakujących ewentualnie atomów wodoru. Często również można określić liczbę wiązań rotacyjnych, które mają warunkować utworzenie ostatecznej konformacji.
Określenie miejsca wiążącego Kolejnym etapem jest określenie miejsca wiążącego ligand (ang. binding site). W białkach można wyróżnić miejsca katalityczne odpowiedzialne za działanie i funkcjonowanie danego białka. W celu np. inhibicji działania, ligand musi przyłączyć się w określone miejsce w białku, dlatego poprawne wyznaczenie tego miejsca jest istotne dla prawidłowego dokowania. Takie miejsce wiążące zaznacza się najczęściej wyimaginowaną sferą bądź też prostopadłościanem (ang. grid box), które określa przestrzeń w jakiej ligand ma być zadokowany, a co za tym idzie zaznacza się, które dokładnie aminokwasy mają brać udział w wiązaniu się z ligandem. Wielkość takiej figury przestrzennej wyraża się w Angstremach (Å), natomiast położenie w przestrzeni zaznacza się w układzie Kartezjańskim. Wyznaczenie takiego miejsca wiążącego opiera się na:
danych literaturowych – w artykułach naukowych można znaleźć opis miejsca wiążącego w danym białku, najczęściej ma on charakter określenie, które aminokwasy pełnią kluczową rolę w oddziaływaniu z ligandem, strukturze krystalicznej kompleksu danego białka z innym ligandem – w tym przypadku określa się miejsce wiążące na podstawie struktury kompleksu innego np. leku związanego z białkiem dzięki znajomości jego współrzędnych Kartezjańskich.