mały|240px|Przykładowy profil genetyczny, wykonany na podstawie analizy 16-układów typu STR Badanie ojcostwa – postępowanie analityczne mające na celu potwierdzenie lub wykluczenie ojcostwa w linii domniemany ojciec – dziecko, wykorzystywane następnie dla celów prywatnych lub sądowychBiblioteka Informacji Technologicznej Kryminalistyki i Medycyny Sądowej, Medycyna Sądowa. Raszeja S., Nasiłowski W., Markiewicz J., Wydawnictwo Lekarskie PZWL, Warszawa 1993,Biologia molekularna w medycynie. Elementy genetyki klinicznej pod redakcją Jerzego Bala; Wydawnictwo PWN, Warszawa 2011,. Badanie ojcostwa obejmuje różne metody analizy pokrewieństwa, stosowane w: klasycznych zestawach testów na ojcostwo, sądowym ustalaniu obowiązku alimentacyjnego, w genetycznym typowaniu śladów biologicznych, identyfikacji osób zmarłych, sprawach o nabycie praw spadkowych po zmarłym, budowaniu genetycznego drzewa genealogicznego, wykreślaniu tablicy pokrewieństw, dowodzeniu pokrewieństwa w państwach, w których prawo imigracyjne zezwala na łączenie rodzinGenetic Relationship Testing. Genetyczne badanie ojcostwa znajduje szczególne zastosowanie w pracy policji, prokuratury oraz sądów, które traktują wyniki tych badań jako najbardziej obiektywny element dowodowyBadania genetyczne w dochodzeniu ojcostwa. Biblioteka Prawa Dowodowego, IES w Krakowie 1998.. Pierwszą technikę badania ojcostwa opublikowano w roku 1984 w AngliiJoseph Wambaugh, The Blooding (New York: A Perigord Press Book, 1989), 83.. Opublikowana przez dr. Jeffreya metoda genotypowania została upowszechniona dopiero w 1987 przez laboratorium Imperial Chemical Industries (ICI), które to otworzyło pierwsze centrum badań ojcostwa w AngliiJoseph Wambaugh, The Blooding (New York: A Perigord Press Book, 1989), 202..
Metody analizy pokrewieństwa Metody genetyczne – analiza DNA Podstawą badań zmienności genetycznej a tym samym ustalania zgodności pokrewieństwa lub też jej braku jest polimorfizm DNA, a więc różnice osobnicze w sekwencji DNA między poszczególnymi osobami. Zmiany w DNA, których częstość występowania w populacji jest mniejsza niż 1%, nazywane są już mutacjami (nie polimorfizmem)Biologia molekularna w medycynie. Elementy genetyki klinicznej Bal J.; Wydawnictwo PWN, Warszawa 2001..
Rodzaje polimorfizmów DNA – podział według sekwencji polimorficznych polimorfizm SNP – najczęściej spotykany polimorfizm pojedynczego nukleotydu (ang. Single Nucleotide Polymorphism); drobne zmiany w badanej sekwencji typu: substytucja (podstawienie nukleotydu), delecja (usunięcie nukleotydu), insercja (wstawienie dodatkowego nukleotydu), polimorfizm minisatelitarny; 7–100 par zasad w powtórzeniu, 2-kilkaset powtórzeń w pojedynczym locus; Zalety: największa heterozygotyczność i wartości współczynników decydujących o przydatności tych polimorfizmów w badaniach sądowych; Wady: czasochłonne metody badań, wynik badania mocno uzależniony od doświadczenia laborantaDNA fingerprinting state of sciences. Birkbauser VB, Switzerland 1993., polimorfizm mikrosatelitarny; 1–6 par zasad w powtórzeniu; 5–100 powtórzeń, polimorfizm najczęściej wykorzystywany obecnie w badaniach ojcostwa, Zalety: pewne genotypowanie, porównywalne częstości alleli w populacji, szybka i zautomatyzowana metodyka badań uniezależniająca wynik badania od biegłości laboranta; łączna ocena 9–13 loci mikrosatelitarnych (zwykle bada się 15–16 loci) równoważy pewność uzyskiwanych wyników przy analizie 5–6 loci minisatelitarnych. Szacuje się, że różnice w sekwencji DNA między ludźmi stanowią ok. 0,1–0,2% genomu, co odpowiada mniej więcej 10 milionom zmian (różnic) typu SNP. Zmiany SNP polegające na podstawieniu (substytucji) nukleotydów stanowią większość zmienności DNA między ludźmi, niemniej w badaniach pokrewieństwa wykorzystuje się również polimorfizmy polegające na występowaniu alleli o różnej liczbie występujących po sobie powtórzeń identycznej sekwencji (polimorfizm mini- oraz mikrosatelitarny). Rozdzielczość a tym samym dokładność i pewność dostępnych metod genetycznych jest różna i zależy zarówno od sumarycznej liczby badanych układów polimorficznych (miejsc na DNA, loci), jak również liczby i częstości występowania odmiennych wariantów alleli w populacji (np. Kaukaskiej) w poszczególnych układach. Upraszczając, dokładność metody jest wprost proporcjonalna do liczby badanych układów (loci) oraz liczby dostępnych w populacji alleli (wersji tego samego genu) obserwowanych u różnych ludzi w tych układach.
Analiza polimorfizmu – podział według liczby badanych miejsc (loci) Analiza jednopunktowa – SLP (ang. Single Locus Polymorphism) – ocena różnicy w miejscu/odcinku jednego locus, występującego na dwóch chromosomach homologicznych, po jednym pochodzącym od ojca i matki badanej osoby, Analiza wielopunktowa – MLP (ang. Multi Locus Polymorphism).
Techniki analizy polimorfizmu genetycznego Technika analizy restrykcyjnej; rodzaj badanego polimorfizmu: sekwencje minisatelitarne, zastosowanie: badanie polimorficznych fragmentów DNA o dużym zróżnicowaniu wielkości (od 1 tysiąca do kilku tysięcy par zasad); analiza jednopunktowa – SLP, Technika hybrydyzacji; rodzaj badanego polimorfizmu: sekwencje minisatelitarne, zastosowanie: badanie polimorficznych fragmentów DNA o dużym zróżnicowaniu wielkości (od 1 tysiąca do kilku tysięcy par zasad), analiza jednopunktowa – SLP np. locus: D7S21, sonda MS31, Technika AmpFLP (ang. Amplification Length Polymorphism), polegająca na powieleniu polimorficznych fragmentów metodą PCR, rozdzieleniu ich na żelu poliakrylamidowym z drabiną alleli oraz wybarwieniu metodą srebrową; rodzaj badanego polimorfizmu: sekwencje minisatelitarne, zastosowanie: badanie polimorficznych fragmentów DNA o wielkości poniżej 1 tys. par zasad; analiza jednopunktowa – SLP, np.: locus D1S80, Technika hybrydyzacji produktów PCR z im mobilizowanymi sondami oligonukleotydowymi, specyficznymi dla poszczególnych alleli, np.: analizy genów struktury HLA DQalfa, Multipleksowa technika PCR – obecnie najczęściej stosowana technika w badaniach ojcostwa – obejmuje jednoczesną analizę kilku do kilkunastu loci sekwencji mikrosatelitarnych (zwykle 15–16 układów STR, o długości od 100–400 par zasad); metoda polega na jednoczesnym powieleniu polimorficznych fragmentów w jednej probówce PCR, rozdzieleniu ich na sekwenatorze (automatycznym sekwenserze) z drabiną alleli oraz porównaniu biostatystycznym uzyskanych wyników analizy wielopunktowej – MLP. Zasada rozdziału: droga migracji znakowanych fluorescencyjnie fragmentów DNA (alleli w układach STR) w trakcie elektroforezy (np. kapilarnej w sekwenatorze) o zadanych parametrach (napięcie, siła jonowa buforu, temperatura, usieciowanie żelu) jest odwrotnie proporcjonalna do logarytmu z wielkości (długości) rozdzielanych fragmentów (im dłuższy allel tym wolniej jest rozdzielany w żelu). Ustalanie wielkości fragmentów i numeryczne oznaczenie alleli poszczególnych układów STR wymaga użycia drabiny alleli – czyli wzorca z wszystkimi występującymi w populacji wariantami alleli, rozdzielanymi równocześnie z próbkami badanego ojcostwa. Technika mikromacierzy SNP – jednoczesna analiza kilku tysięcy loci typu SNP; technologia wysokorozdzielcza; z powodu wysokiego kosztu badań nie znajduje nadal powszechnego zastosowania, Sekwencjonowanie genomowe – odczyt całej sekwencji DNA człowieka, w tym wszystkich możliwych polimorfizmów i mutacji; technologia najbardziej dokładna, niemniej niedostępna jeszcze dla badań rutynowych z powodu wysokiego kosztu analiz (kilkadziesiąt -kilkaset tysięcy PLN/próbkę);
Typy analizowanego polimorfizmu genetycznego Analiza polimorfizmu typu SNP SNP stanowią ok. 90% całej zmienności występującej w ludzkim genomie (ok. 3 mld nukleotydów) i występują co ok. 100–300 nukleotydów. W przypadku polimorfizmu SNP, mimo możliwości badania ogromnej ilości zmiennych miejsc (loci) typu SNP na genomowym DNA (ok. 10 milionów), maksymalna liczba dostępnych alleli dla pojedynczego miejsca to zaledwie 4, co w uproszczeniu odpowiada możliwości substytucji tylko jednego z czterech nukleotydów A, G, C lub T. Niski współczynnik dyskryminacji metod opartych na badaniach SNP można jednak będzie w przyszłości istotnie poprawić wraz z rozwojem technologii analitycznych, rekompensujących małą zmienność alleli SNP (A, G, C, T) możliwością oznaczania większej liczby badanych loci (ok. kilkudziesięciu), przy zachowaniu niskiej ceny badania. SNP przewyższa inne typy polimorfizmów możliwością wykazywania podstruktur populacyjnych zarówno w badaniach sądowych, jak i genealogicznych. Niestety koszty tego typu badań na podniesionym poziomie rozdzielczości (np. mikromacierze SNP, DNA-chip) są nadal wysokie, co ogranicza ich powszechne zastosowanieBiuletyn Informacji Technologicznej Kryminalistyki i Medycyny Sądowej (BITKiMS).
Analiza mirkosatelitarnych układów STR chromosomów somatycznych Najbardziej rozpowszechnione są obecnie metody oparte na analizie układów STR (sekwencji mikrosatelitarnych)- innego typu polimorfizu, polegającego na występowaniu w populacji alleli o zmiennej liczbie (5–100) powtórzeń tandemowych zbudowanych od 1 do 6 nukleotydów (np. (CATG)n lub (CA)n), rozłożonych równomiernie co 6–10 tys. par zasad. Różne allele układów STR występują zwykle w populacji w liczbie od kilku do kilkunastu, co znacznie zwiększa zdolności rozdzielczą tych metod w porównaniu z analizą zmienności SNP, przy badaniu tej samej liczby układów (loci). W genomie człowieka znajduje się ok. 100 tys. loci z tym typem sekwencji, w większości specyficznych dla człowieka i zlokalizowanych najczęściej w sekwencjach flankujących geny oraz intronach (obszarach niekodujących). W badaniach ojcostwa wykorzystuje się wybrane sekwencje mikrosatelitarne, które charakteryzuje duża liczba alleli w populacji (wysoki współczynnik dyskryminacji) oraz stosunkowo mała długość całkowita (100–400 par zasad). Technologie analizy układów STR umożliwiają obecnie badanie 15–16 loci występujących na chromosomach somatycznych (nie płciowych) oraz markera płci (amelogeniny) w jednej reakcji multipleksowego PCR, co umożliwia uzyskanie wyniku wykluczenia ojcostwa ze 100% pewnością lub potwierdzenie ojcostwa z co najmniej 99,999% pewnością. Proces technologiczny obejmuje zwykle: 1) pobranie materiału biologicznego (najczęściej wymazu z jamy ustnej), 2) izolację i oczyszczanie DNA, 3) amplifikację (powielenie) układów STR na matrycy wyizolowanego DNA (zwielokrotnienie liczby kopii wybranych fragmentów DNA z 1 do ok. biliona), 4) rozdział wyznakowanych fluorescencyjnie fragmentów DNA (STR) na sekwenatorze (zwykle kapilarnym), 5) analiza porównawcza uzyskanych profili DNA, 6)analiza statystyczna, 7) wydanie ekspertyzy.
Analiza mikrosatelitarnych układów STR chromosomu Y