Według relacji Agostina Vespucciego z jesieni 1503 roku, Leonardo miał już namalować głowę św. Anny. W czasie powstawania Świętej Anny Samotrzeciej uczniowie Leonarda malowali jednocześnie kopie obrazu. Antonina Vallentin podaje, że niektóre fragmenty Świętej Anny podmalowywał Cesare da Sesto. Leonardo zaś miał namalować twarze kobiet, ubrania i kontury krajobrazu. Leonardo nigdy nie dostarczył obrazu zakonnikom. Obraz zatrzymał przy sobie, do końca nanosił do niego kolejne poprawki.
Obraz prawdopodobnie kupił król Francji Franciszek I Walezjusz od Giacoma Caprottiego „Salaia” w 1518 roku. Salai wycenił obraz na 200 skudów. Obraz należał również do rzeźbiarza i bibliofila Pompea Leoniego. Spadkobiercy po nim bezskutecznie próbowali sprzedać obraz ok. 1614 roku. W XVII wieku w Casale Monferrato w Piemoncie znajdował się obraz Święta Anna, jednak nie wiadomo, czy było to oryginalne dzieło Leonarda czy replika. Obraz ten miał kupić Armand Jean Richelieu dla króla Ludwika XIII. W 1651 roku Święta Anna Samotrzecia trafiła do Palais Cardinal (ob. Palais-Royal) w Paryżu.