Chirurgia thumb|Billroth i jego asystenci (1871) Billroth pracował jako lekarz w latach 1853–1860 w klinice Charité. W Berlinie był również uczniem Carla Langenbucha. W latach 1860–1867 był profesorem na Uniwersytecie w Zurychu i dyrektorem szpitala chirurgicznego i kliniki w Zurychu. Pracując na tym stanowisku opublikował w 1863 roku swoje dzieło Die allgemeine chirurgische Pathologie und Therapie (patologia ogólna w chirurgii i terapia). W tym samym czasie podał propozycje wygłoszeń, prezentowania wyników, dobrych i złych, co zaowocowało uczciwą dyskusją o zachorowalności, śmiertelności i technikach ulepszając w rezultacie dobór pacjentów. W 1867 Billroth został mianowany profesorem Uniwersytetu Wiedeńskiego i odtąd praktykował chirurgię jako kierownik II Kliniki Chirurgii w Allgemeine Krankenhaus Szpitala Ogólnego w Wiedniu.
Billroth był odpowiedzialny za wiele przełomowych wydarzeń w medycynie, takich jak pierwsza ezofagektomia (1871), pierwsza laryngektomia (1873) i pierwsza udana gastrektomia z powodu raka żołądka w 1881 roku, za co operację tę nazwano jego nazwiskiem (operacja Billroth I i operacja Billroth II).