Doświadczenia z tego okresu utwierdziły go w przekonaniu, że Bóg powierzył mu misję kaznodziei i przywódcy ruchu reformacyjnego w Szkocji, chociaż w swych młodzieńczych planach nie brał pod uwagę kariery uczonego i nauczyciela. W tych latach król Anglii i zdecydowany zwolennik protestantyzmu Edward VI, szukając oparcia dla programu reform, postanowił uciec się do autorytetu dysponujących siłą przekonywania kaznodziejów. Knox został członkiem elitarnej grupy duchownych posiadających specjalne upoważnienia, a wysłany do Berwick-upon-Tweed w północnej Anglii, przywrócił tam spokój i założył zbór protestancki. W tym czasie pełnił też funkcję nadwornego kaznodziei królewskiego i nauczał na obszarze niemal całej Anglii.
W trakcie działalności na terenie Szkocji odegrał wiodącą rolę w nadaniu Kościołowi w tym kraju surowego profilu moralnego, prezbiteriańskiej, demokratycznej struktury organizacyjnej oraz odprawianej w języku ludu liturgii. Jego najważniejszym utworem pisarskim była praca pt. History of Reformation in Scotland ("Historia reformacji w Szkocji").