Na początku lat 20. XVI w. Cabot szukał wsparcia dla kolejnej wyprawy do Nowej Fundlandii u Henryka VII. Król, Thomas Wolsey (1471/1474–1530) i rada królewska poparli projekt, który wsparli również kupcy z Bristolu. Jednak wobec braku zaangażowania kupców londyńskich, wsparcie okazało się niewystarczające i Cabot wrócił do Hiszpanii.
W 1526 roku Cabot został kapitanem hiszpańskiej wyprawy do Indii szlakiem wokół Ameryki Południowej. W ekspedycji popłynęły cztery statki z 200 uczestnikami. Z uwagi na relacje o bogactwach Ameryki Południowej, Cabot zmienił kurs wyprawy pomimo buntu innych uczestników i wpłynął na rzekę La Platę. Przy ujściu San Salvador do Urugwaju założył fort San Salvador. Poszukiwał złota w regionie Parany, Río Carcarañá i Paragwaju. Nad Río Carcarañá założył fort Sancti Spiritus. Zimę 1528–1529 spędził w San Salvador, a wiosną kolejnego roku udał się do Sancti Spiritus, który został wcześniej zdobyty przez Indian. Cabot podjął decyzję o powrocie i przybył do Sewilli latem 1530 roku.
Wobec niepowodzenia wyprawy Cabot został pociągnięty do odpowiedzialności i skazany na zesłanie do Afryki. Kary nigdy jednak nie odbył, a od 1532 roku ponowie wykonywał obowiązki głównego pilota.