Historia Uniwersytet powstał w czasie wielkiej schizmy. Został ufundowany w 1386 r. przez Ruprechta I, elektora Palatynatu, na mocy bulli papieża Urbana VI wydanej 23 października 1385 r. Był trzecim uniwersytetem Świętego Cesarstwa Rzymskiego (po uniwersytetach w Pradze i Wiedniu). Celem powstania uniwersytetu było nauczanie filozofii, teologii, prawoznawstwa oraz medycyny. Pierwszym rektorem był, sprowadzony z Sorbony, nominalista Marsyliusz z Inghen. Jednym z kolejnych rektorów był koncyliarysta Mateusz z Krakowa.
Reformacja wywarła duży wpływ na uniwersytet, stał się on wówczas centrum kalwinizmuMolik, Witold. Polacy na Uniwersytecie w Heidelbergu 1803-1870. Kwartalnik Historii Nauki i Techniki 27.2 (1982), s. 316.. Wydany w 1563 roku Katechizm Heidelberski był, w dużym stopniu, opracowany przez osoby związane z uczelnią.
W czasie wojny trzydziestoletniej intelektualne i finansowe znaczenie uniwersytetu uległo osłabieniu. W 1622 roku, po zdobyciu Palatynatu przez wojska Ligi Katolickiej, zbiory Bibliotheca Palatina zostały wywiezione do Rzymu.
W 1693 roku, w trakcie wojny z Francją, uniwersytet został zniszczony i czasowo zamknięty.