W 1940 roku został mianowany kandydatem Partii Republikańskiej na prezydenta i zmierzył się z ubiegającym o bezprecedensowy trzeci wybór Rooseveltem. W walce o nominację pokonał tak znanych polityków jak senator Robert A. Taft z Ohio czy prokurator (jeszcze nie gubernator) Thomas Dewey. Jest jak dotąd jedyną osobą pochodzącą z Indiany, która uzyskała nominację prezydencką jednej z dwóch głównych amerykańskich partii.
Willkie przegrał z Rooseveltem stosunkiem 54,8 do 44,8 procent (oddano na niego 22.305.198 głosów podczas gdy na Roosevelta 27.244.160). Willkie wygrał wybory w dziesięciu stanach, w tym w rodzinnej Indianie i uzyskał 82 głosy elektorskie (Roosevelt zebrał ich 449). Urzędujący prezydent poważnie obawiał się możliwości jeżeli nie zwycięstwa, to w każdym razie przeciągnięcia przez Willkiego wielu osób na stronę republikanów. Obaj przeciwnicy darzyli się ponoć dużym szacunkiem.
Po swojej porażce został nieoczekiwanie bliskim nieformalnym współpracownikiem Roosevelta, którego poglądy na rolę międzynarodową USA podzielał cały czas, także w czasie kampanii, któremu pomagał pozyskać republikanów do tej sprawy i był także wysłannikiem w różne części świata.