W opozycji antyelektorskiej Otto von der Groeben w 1602 po raz pierwszy wystąpił w obronie praw stanów pruskich na sejmie krajowym, który zebrał się w Świętej Siekierce. Po śmierci Jerzego Fryderyka stał się jednym z przywódców opozycji jawnie występującej przeciw elektorowi Brandenburgii Joachimowi Fryderykowi. Opozycjoniści opowiadali się za zespoleniem Prus Książęcych z Koroną. Od 1604 opozycję w pruskim sejmie nazywano kwerulantami.
W styczniu 1609 przewodniczył delegacji szlachty pruskiej na sejm w Warszawie. Głośne były jego przemówienia w sejmie i senacie. Podkreślał, że szlachta pruska jest częścią składową Rzeczypospolitej i powinna mieć takie same prawa jak szlachta polska. Występował przeciw Hohenzollernom łamiącym prawa pruskie, sprzeciwił się oddaniu Brandenburczykom pod kuratelę Prus Książęcych, uważał, że doprowadzi to do oderwania lenna od Polski. Na audiencji u Zygmunta III wręczył pismo w sprawie zorganizowania administracji w Prusach Książęcych na wzór polski. Efektem tych działań było wysłanie do Prus komisarzy królewskich, jeszcze w 1609.
Rządy Jana Zygmunta nie spełniły oczekiwań Groebena, w latach 1611–1615 nastąpiło wznowienie działalności partii opozycyjnej w pruskim sejmie.