Podczas pobytu w Cali, mediował w sporze sądowym między Sebastiánem de Belalcázar i Pascalem de Andagoya.
Jako gubernator Peru Ciągle w drodze do Peru, w Popayán, dowiedział się o zabójstwie Francisco Pizarro i wyborze Diego de Almagro Młodszego na gubernatora. Przybył do Quito 25 września 1541, gdzie zjednoczył siły królewskie przeciw niemu. Mianował siebie gubernatorem kolonii. Wsparty przez Francisca de Carvajala, pokonał Almagro 16 września 1542 na równinie Chupas. Almagro próbował uciec po klęsce, ale został uwięziony. Naciskany przez stronników Pizarra, Vaca de Castro zarządził jego egzekucję.
W 1542 wprowadzono Nowe Prawo mające na celu ograniczenie encomiendy. Nowe Prawo spowodowało trudności dla Vaca de Castro z Gonzalo Pizarro i innymi zwolennikami starego systemu. Vaca de Castro zgodził się przedstawić ich stanowisko Koronie. Następnie skoncentrował swoje wysiłki na rozwoju kraju, poprzez poprawę komunikacji, regulując zajazdy dla podróży poprzez kontynent oraz nadzór wykorzystywania pracy w kopalniach.
W 1543 roku wysłał Diego de Rojasa i 200 mężczyzn do Río de la Plata. Tej wyprawie jest przypisywane odkrycie Tucumán.