W tym czasie szpital wyspecjalizował się w leczeniu gruźlicy i chorób płuc.
mały|lewo|Szpital Wolski w okresie okupacji niemieckiej podczas II wojny światowej Podczas II wojny światowej w szpitalu funkcjonował Wydział Medyczny podziemnego Uniwersytetu Warszawskiego i Uniwersytetu Ziem Zachodnich. Jego personel brał udział w działalności antyniemieckiej. W 1941 r. w trakcie pozorowanej operacji dokonano zamiany więzionego przez gestapo Stanisława Miedzy-Tomaszewskiego na zwłoki innego mężczyzny, co stanowiło finałowy etap akcji odbicia go z Pawiaka. 30 marca 1943 r. w wyniku obrażeń odniesionych w czasie przesłuchań prowadzonych przez Gestapo w szpitalu zmarł Jan Bytnar „Rudy”, natomiast 4 lutego 1944 r. – ciężko ranny dowódca akcji Kutschera Bronisław Pietraszewicz „Lot”.
Podczas rzezi Woli 5 sierpnia 1944 r. w szpitalu zastrzeleni zostali: dyrektor – doktor Józef Marian Piasecki, pediatra profesor Janusz Zeyland oraz ksiądz kapelan Kazimierz Ciecierski. Personel szpitala oraz chorzy zostali rozstrzelani przy ul. Górczewskiej. Już po kilku dniach Szpital Wolski wznowił jednak działalność pod kierownictwem dr. Zbigniewa Woźniewskiego. Personel szpitala aż do drugiej połowy października 1944 r. niósł pomoc polskiej ludności cywilnej wypędzanej przez Niemców z Warszawy.