Została ona porwana i uprowadzona do Hiszpanii przez tajemniczą okultystyczną organizację. Leon wyrusza jej tropem i dociera do oddalonej od cywilizacji hiszpańskiej wioski. Tym razem na swej drodze nie spotyka zombie, a zakażonych Las Plagas agresywnych mieszkańców. Podczas wykonywania misji spotyka starych znajomych: Adę Wong i Jacka Krausera, z którym rozpoczynał szkolenie w USA na tajnego agenta. Po uwolnieniu Ashley, przywódca „Los Illuminatos” (z hiszpańskiego: Oświeconych) Osmund Saddler, nakazuje swoim podwładnym odzyskanie prezydenckiej córki. Udaje się to w zamku Ramona Salazara insektodalnym Novistadorom (z hiszpańskiego: Niewidocznym dla ludzi). Zmusza to Leona do podróży na pobliską wyspę, która jest zmilitaryzowano-badawczym kompleksem wykorzystywanym przez ludzi Saddlera. Tu Leon pokonuje z pomocą Ady zmutowanego Saddlera i zdobywa próbkę Master Plaga, lecz – Ada zmusza Leona do oddania próbki i ucieka z wyspy śmigłowcem. Zachęca Leona do tego samego aktywując ładunki umieszczone na całej wyspie i oddaje mu kluczyki do skutera wodnego. Mając 3 minuty do detonacji, Leon i Ashley uciekają na nim.