W 1871 w Pałacu Czartoryskich otworzono Instytut Gospodarstwa Wiejskiego i Leśnictwa, w którym również powstała domowa cerkiew – pod wezwaniem Opieki Matki Bożej (konsekrowana 20 października 1871 przez arcybiskupa Joannicjusza). 15 kwietnia 1877 erygowano samodzielną parafię prawosławną w Puławach, a w 1884 z inicjatywy ks. Jurija Tatarowa założono na Włostowicach cmentarz parafialny (wchodzący obecnie w skład cmentarza rzymskokatolickiego). Nieco wcześniej nieopodal cerkwi zbudowano dzwonnicę (rozebraną w 1915). W 1904 na terenie dzisiejszego Opola Lubelskiego wzniesiono cerkiew filialną, również pod wezwaniem Opieki Matki Bożej, a w 1909 w Puławach – cerkiew polową pod wezwaniem Świętej Trójcy, przeznaczoną dla 71 Bielowskiego Pułku Piechoty, stacjonującego w Puławach. W 1913 zbudowano murowaną kaplicę cmentarną.
Działalność parafii została przerwana w czasie I wojny światowej, kiedy to ludność prawosławna wraz z wojskami carskimi udała się w głąb Rosji (bieżeństwo).