Pierwsza pisemna wzmianka o klasztorze pochodzi jednak dopiero z 1520.
W 1592 monaster został napadnięty przez Kozaków-uczestników powstania Kosińskiego, którzy pobili przełożonego i mnichów klasztoru, zarzucając im ukrywanie na terenie monasteru złodzieja.
Znaczenie monasteru jako duchowego ośrodka Kozaczyzny Na początku XVII w., gdy przełożonym klasztoru był ihumen Atanazy, znaczenie wspólnoty dla ruskiej ludności prawosławnej znacznie wzrosło i stało się porównywalne z autorytetem Ławry Pieczerskiej w Kijowie. W pierwszych dekadach XVII stulecia kompleks klasztorny został rozbudowany o trzy drewniane cerkwie: św. św. Piotra i Pawła, refektarzową świątynię św. Mikołaja oraz sobór Przemienienia Pańskiego.
Monaster utrzymywał bliskie kontakty z bractwami prawosławnymi we Lwowie i w Kijowie. Kandydaci na mnichów wywodzący się z grona uczniów szkoły brackiej w Kijowie odbywali w Monasterze Międzygórskim nowicjat przed wstąpieniem do brackiego klasztoru w Kijowie. Zakonnicy monasteru wsparli powstanie Chmielnickiego. Na terenie klasztoru przechowywana była broń na użytek Kozaków, zaś część mnichów dołączyła do powstańczych oddziałów. 21 maja 1651 Bohdan Chmielnicki osobiście ogłosił się ktitorem klasztoru, zaś kosz zaporoski przekazał monasterowi część zdobyczy wojennych.