Wierność z jaką artysta je przedstawił była zapowiedzią realistycznego kierunku w XVII wiecznym pejzażu holenderskim. Hoefnagel jest autorem czterotomowego manuskryptu, zawierającego tysiące miniatur przedstawiających świat zwierzęcy podzielony na cztery żywioły: Animalia rationalia et insecta, Animalia quadrupedia et reptilia, Animalia aquatilia et conchiliata i Animalia volatilia et amphibia. Praca powstała w latach 1575–1582, obecnie jest rozproszona i znajduje się w różnych kolekcjach (w Waszyngtonie, Berlinie, Paryżu, Pradze i Weimarze)Dawniej manuskrypt w całości znajdował się w kolekcji Rosenwalda i w zbiorach cesarza Rudolfa II.
W latach 1594–1596 stworzył botaniczne iluminacje dla kaligraficznego kodeksu Rudolfa II. Iluminacje stanowiące w wielu przypadkach samodzielne kompozycje oraz osobne obrazy na pergaminie namalowane w 1594 i 1597 przyczyniły się do powstania gatunku martwej natury kwiatowej i wywarły duży wpływ na twórczość Roelandta Savery'ego i Jacoba de Gheyna II. Prócz tych najważniejszych prac Hoefnagel stworzył m.in.