2 lutego 1939 roku okręt został oficjalnie włączony do Marynarki Wojennej. W składzie Dywizjonu Okrętów Podwodnych, „Orzeł” wziął udział w początkowym okresie obrony Wybrzeża. Internowany w stolicy Estonii, zdołał zbiec. Pozbawiony map, do 7 października kontynuował patrol na Bałtyku, po czym przez cieśninę Sund przepłynął do Wielkiej Brytanii.
Operując z Wysp Brytyjskich, 8 kwietnia 1940 roku podczas patrolu na Morzu Północnym, zatopił niemiecki frachtowiec „Rio de Janeiro”, przewożący wojska niemieckie w ramach operacji Weserübung – informacja przekazana przez „Orła” była jednym z pierwszych sygnałów świadczących o niemieckiej inwazji na Norwegię.
Z niewyjaśnionych do dziś przyczyn, ORP „Orzeł” zaginął wraz z całą załogą podczas patrolu na Morzu Północnym na przełomie maja i czerwca 1940 roku.