Cerkiew została ukończona w 1532, a poświęcił ją biskup kołomieński Wassian (Toporkow). W pobliżu świątyni w XVI w. wzniesiono również dzwonnicę, w której urządzono niewielką cerkiew św. Jerzego.
Niezależnie od intencji, z jakimi była wznoszona, cerkiew odgrywała również symboliczną rolę w projekcie uczynienia Moskwy Trzecim Rzymem i Nową Jerozolimą, centrum prawdziwego chrześcijaństwa. Wzgórze, na którym znajduje się Kołomieńskie, w nowej symbolice przestrzeni stolicy Rosji odgrywało rolę Góry Oliwnej. Architektura cerkwi miała zatem obrazować Wniebowstąpienie Pańskie, a zarazem powtórne przyjście Chrystusa, symbolizować potęgę Rusi – świętej ziemi wybranej przez Boga. Do ukończenia prac nad dzwonnicą Iwana Wielkiego cerkiew Wniebowstąpienia Pańskiego była najwyższą budowlą w Moskwie (jej wysokość przekracza 60 m).