GroEL je protein koji pripada porodici molekulskih šaperona pratioca, a nalazi se u velikom broju bakterija Potreban je za efikasno savijanje mnogih proteina. Da bi učinkovito funkcionirao, GroEL zahtijeva kompleks poklopca GroES, povezan s proteinima. Kod eukariota to su proteini Hsp60 i Hsp10, strukturno i funkcionalno gotovo identični GroEL-u odnosno GroES-u. Slična struktura proteina postoji u hloroplastima određenih biljaka. Ovo prisustvo proteina pruža dokaze o evolucijskoj vezi razvoja mitohondrija i hloroplasta preko endosimbioze.
Mehanizam djelovanja U ćeliji, GroEL/ES posredovani proces savijanja proteina uključuje brojne sekvence vezanja, enkapsulacija i oslobađanja proteinsdkog supstrata. Nesavijeni supstratni proteini vežu se za hidrofobno područje na unutrašnjem rubu otvorene šupljine GroEL-a, formirajući binarni kompleks sa šaperonino. Vezanje proteindkog supstrata na ovaj način, pored ATP-vezanja, dovodi do konformacijske modifikacije koja omogućava pridruživanje binarnog kompleksa sa različitom strukturom poklopca, GroES. Veza GroES-a sa otvorenom šupljinom šaperonina uzrokuje da se pojedine podjedinice šaperonina rotiraju, tako da se vezani hidrofobni supstrat ukloni iz unutrašnjosti šupljine, što izaziva izbacivanje supstratnog proteina iz ruba u sada hidrofilnu komoru. Hidrofilna sredina komore omogućava uvezivanje hidrofobnih ostatka supstrata, što inducira savijanje supstrata. Hidroliza ATP-a i vezanje novog supstratnog proteina u suprotnoj šupljini šalje alosterni signal, koji uzrokuje oslobađanje GroES-a i enkapsuliranih proteina u citosolu. Dati protein će se podvrći nekoliko sklopivih ciklusa, svaki put vraćajući se u prvobitno nesavijeno stanje, dok se ne proizvede izvorna konformacija ili posredna struktura namijenjena za „domorodačko“ stanje. Alternativno, supstrat se može denaturirati tokom konkurentne reakcije, kao što su loše sklapanje ili agregacija sa drugim slabo presavijenim proteinima
Termodinamika reakcije Kontraktilna priroda unutrašnjosti molekularnog kompleksa snažno favorizira kompaktne molekulske konformacije supstratnog proteina. U rastvoru, apolarne i dalekometne interakcije mogu se pojaviti samo u ovom slučaju sa značajnim troškom u entropiji. U zatvorenim prostorima GroEL kompleksa, relativni gubitak entropije je mnogo manji. Metod hvatanja također teži da koncentrira apolarna mjesta vezanja, odvojeno od polarnih mjesta. Kada se GroEL-ova apolarna površina ukloni, šansa da bi bilo koja data apolarna grupa mogla naići na intramolekulsko apolarno mjesto je daleko veća nego u rastvoru. Hidrofobna nalazišta koja su vani okupljena su na vrhu CIS domena i međusobno povezana. GroEL-ova geometrija zahtijeva da polarne strukture budu motorne, a one omotavaju apolarnu srž kada izađu sa trans-strane.
Struktura thumb|250px|Heptamer proteina HSP60 E. coli GroEL je strukturno dvostruko prstenasti tetradar, sa cis i trans prstenovima koji se sastoje od po sedam podjedinica. Unutrašnjost GroEL-a je hidrofobna i tu bi trebalo da se oiviči proteinsko savijanje.
Ključ GroEL-ove aktivnosti je u strukturi monomera. Monomer Hsp60 ima tri različita dijela, odvojena sa dvije pivotne regije. Apeksna regija sadrži veliki broj mjesta vezanja za nesavijene proteinske supstrate. Mnogi globularni proteini se neće vezati za ovu apeksnu regiju jer su njihovi hidrofobni dijelovi unutrašnji, daleko od vodenog medija, u konformaciji koja je im je favorizirala termodinamiku. Kao rezultat toga, ova "supstratna mjesta" se vežu samo sa proteinima koji nisu optimalno presavijeni. Ta vršna regija ima i obavezujuća mjesta za GroES Hsp10 monomere.
Ekvatorski domen ima lokaciju u blizini ključne tačke za povezivanje ATP-a, kao i dvije spojne tačke za drugu polovicu GroEL molekule. Ostatak ekvatorijalne regije je umjereno hidrofilan.
Dodavanje ATP-a i GroES-a dovodi do radikalne promjene u konformaciji CISregije. Uzrokovan je savijanjem i rotacijom Hsp60 monomera na tačkama šarke. Srednji region se savija prema unutra, oko 25 stepeni od najniže šarke. Ovaj efekt, pomnožen kooperativnim sklopilom monomera, povećava ekvatorijalni promjer GroEL kafeza. Ali apski domen se rotira za 60 stepeni prema van u odnosu na gornje šarke, a također i 90 stepeni oko osi šarke. Ovo kretanje otvara kafez široko iznad cis regiona, ali uklanja sva mjesta koja se vežu iz unutrašnjosti. Ova je struktura obično u ravnoteži sa svakom od njenih pojedinačnih komponenti: monomerima, heptamerima i tetradeceamerima. Nedavna istraživanja sugerirala da se, pored svog tipskog položaja u mitohondrijama, HSP60 može naći i u citoplazmi u normalnim fiziološkim uvjetima.
Svaka podjedinica HSP60 ima tri domena: apikalni (vršni), ekvatorski i srednji (intermedijarni) domen. Ekvatorski sadrži mesto vezanja za ATP i za drugi heptamerni prsten. Srednji domen povezuje skupa ekvatorski i apikalni domen. Intermedijerni domen izaziva konformacijsku promjenu kada je ATP vezan, omogućavajući izmjenu između hidrofilnih i hidrofobnih mjesta vezanja supstrata. U svom neaktivnom stanju protein je u hidrofobnom stanju. Kad se aktivira pomoću ATP-a, ovaj domen podliježe konformacijskoj promjeni, koja izlaže hidrofilno područje. Ovo osigurava vjernost u vezanju s proteinima. Šaperonin 10 pomaže HSP60 u presavijanju, djelujući kao kupolasti pokrov na aktivnom ATP obliku HSP60. To dovodi do povećanja centralne šupljine i pomaže u savijanju proteina. thumb|Monoklonsko antitelo na HSP60 korišćeno je za bojenje ljudskih HeLa ćelija, uzgajanih u kulturi tkiva. Antitelo otkriva ćelijske mitohondrije u crvenoj boji. Plavi signal je posljedica boje koja veže DNK i otkriva ćelijska jedra. Bojenje antitela i slika ljubaznošću kompanije EnCor Biotechnology Inc.
thumb|center|250|Trodimenzijska struktura proteina HSP60.;
Sekvenca mitohondrijskog HSP60 sadrži niz ponavljanja G na C-kraju. Struktura i funkcija ove sekvence nisu sasvim poznati. N-kraj sadrži predsekvencu hidroksiliranih aminokiselina: arginin, lizin, serin i treonin, koji služe kao usmjerivači za unos proteina u mitohondrije.
Predviđena struktura HSP60 uključuje nekoliko vertikalnih sinusnih talasa, alfa-heliksa, beta-listova i rotiranja za 90 stepeni. Postoje regije hidrofobnosti u kojima se protein vjerojatno proteže kroz membranu. Postoje i tri N-vezana mjesta glikozilacije na pozicijama 104, 230, 436. Sekvenca i sekundarna struktura za mitohondrijski protein ilustrirani su gornjom slikom dobivenom iz banke proteinskih podataka.
Noviji podaci sugeriraju da se HSP60 pronađen u mitohondrijima razlikuje od onog u citoplazmi. Što se tiče aminokiselinske sekvence, citoplazmatski HSP60 ima sekvencu N-kraja koja nije pronađena u mitohondrijskom proteinu. U analizi gelnom elektroforezom, pronađene su značajne razlike u migraciji citoplazmatskih i mitohondrijskih HSP60. Citoplazmatski HSP60 sadrži signalnu sekvencu od 26 aminokiselina na N-kraju. Ova sekvenca je visoko degenerirana i sposobna je da se presavije u amfifilnu spiralu. Antitijela protiv HSP60 ciljaju i mitohondrijski i citoplazmatski oblik. Ipak, antitela protiv signalne sekvence usmjerenea su samo na citoplazmatski oblik. U normalnim fiziološkim uvjetima, oboje se nalaze u relativno jednakim koncentracijama. U vrijeme stresa ili velike potrebe za HSP60 bilo u citoplazmi ili u mitohondrijima, ćelija je sposobna za kompenzaciju, povećavanjem prisustva HSP60 u C–1 Proteini toplotnog šoka, prvenstveno su odgovorni za održavanje integriteta ćelijskih proteina, posebno kao odgovor na promjene u okolini. Stresovi poput temperature, neravnoteže koncentracije, promjene pH i toksina mogu podstaknuti sve proteine toplotnog šoka da održe konformaciju ćelijskih proteina. HSP60 pomaže u presavijanju i održavanju konformacije približno 15-30% svih ćelijskih proteina. Pored tipske uloge HSP60 kao proteina toplotnog šoka, studije su pokazale da ima i važnu ulogu u transportu i održavanju mitohondrijskih proteina, kao i transmisiji i replikaciji mitohondrijskih DNK.
Transport proteina u mitohondrijama HSP60 ima dvije glavne uloge u pogledu transporta mitohondrijskih proteina. Funkcionira da katalizira presavijanje proteina namijenjenih matrici i održava protein u rasklopljenom stanju za transport kroz unutrašnju membranu mitohondrija. Mnogi proteini su ciljani za preradu u matriksu mitohondrija, ali se zatim brzo iznose u druge dijelove ćelije. Hidrofobni dio HSP60 odgovoran je za održavanje nerazvijene konformacije proteina za transmembranski transport. Studije su pokazale kako se HSP60 veže za dolazne proteine i izaziva konformacijske i strukturne promjene. Naknadne promjene u koncentracijama ATP hidroliziraju veze između proteina i HSP60, što signalizira proteinu da izađe iz mitohondrija. HSP60 je također sposoban razlikovati proteine namijenjene izvozu i proteine koji će ostati u matrici mitohondrija u potrazi za amfifilnim alfa-heliksom od 15-20 ostataka. Postojanje ove sekvence signalizira da protein treba izvesti, dok odsustvo signalizira da protein treba ostati u mitohondrijima . Precizan mehanizam još nije u potpunosti poznat.
Metabolizam DNK Pored svoje ključne uloge u presavijanju proteina, HSP60 je uključen u replikaciju i prenos mitohondrijske DNK. U opsežnim studijama aktivnosti HSP60 u Saccharomyces cerevisiae, istraživači su predložili da se HSP60 preferencijalno veže za jednolančani predložak DNK.Mutacije u HSP60 povećavaju nivo mitohondrijske DNK i rezultiraju naknadnim defektima prenosa.
Citoplazmatskii vs mitohondrijski HSP60 Pored već ilustriranih strukturnih razlika između citoplazmatskog i mitohondrijskog HSP60, postoje i značajne funkcionalne razlike. Studije su sugerirale da HSP60 ima ključnu ulogu u prevenciji apoptoze u citoplazmi. Citoplazmatski HSP60 tvori kompleks sa proteinima odgovornim za apoptozu i regulira aktivnost tih proteina. Citoplazmatska verzija također je uključena u imunski odgovor i rak. Bliska nedavna istraživanja započela su sugerirati regulatornu korelaciju između HSP60 i glikolitskog enzima 6 - fosfofruktokinaza-1. Iako nema mnogo podataka, koncentracije citoplazmatskog HSP60 uticale su na ekspresiju 6-fosfofruktokinaze u glikolizi. Unatoč ovim izraženim razlikama između citoplazmatskog i mitohondrijskog oblika, eksperimentalna analiza pokazala je da je ćelija brzo sposobna da premjesti citoplazmatski HSP60 u mitohondrije ako uslovi okoline zahtijevaju veće prisustvo mitohondrijskog HSP60.
Sinteza i sklapanje HSP60 se obično nalazi u mitohondrijama i pronađen je u organelama endosimbiotskog porijekla. HSP60 monomere tvore dva heptamerna prstena, koji se vežu za površinu linearnih proteina i kataliziraju njihovo savijanje u procesu ovisnom o ATP-u. Podjedinice HSP60 kodiraju se jedarnim genima] i prevode u citosol. Te se podjedinice zatim premještaju u mitohondrije, gdje ih obrađuju druge molekule HSP60. Nekoliko studija pokazalo je kako proteini HSP60 moraju biti prisutni u mitohondrijama za sintezu i sastavljanje dodatnih komponenata HSP60. Postoji direktna pozitivna korelacija između prisustva proteina HSP60 u mitohondrijama i proizvodnje dodatnih kompleksa proteina HSP60.
Kinetika sastavljanja podjedinica HSP60 u 2-heptamerne prstenove traje dvije minute. Naknadni, proteaza-rezistentni HSP60 nastaje u poluvremenu od 5–10 minuta. Ova brza sinteza ukazuje da postoji interakcija ovisne o ATP-u, gdje formirani kompleks HSP60 stabilizira intermedijer kompleksa za sastavljanje HSP60, koji efektivno služi kao katalizator. Potreba prethodno postojećeg HSP60, kako bi se sintetizirale dodatne molekule HSP60, podržava teoriju endosimbiotskog porijekla mitohondrija. Sigurno je postojao rudimentni prokariotski homologni protein koji je bio sposoban za sličan samookupljanje i smanjenje koncentracije u suprotnom odjeljku.
Interakcije GroEL je pokazao da je u interakciji sa GroES-om4,5, ALDH25, kaspasa 34,6 i dihidrofolat-reduktazom. Reference
Dopunska literatura
Vanjski linkovi
(No rights reserved) 3D macromolecular structures of GroEL in EMDB