thumb|right|300px| Radni tok čipovanog sekvenciranja Hromatinska imunoprecipitacija (ChIP) je tip imunoprecipitacijske eksperimentalne tehnike koja se koristi za istraživanje interakcije između proteina i DNK u ćeliji. Cilj mu je utvrditi da li su specifični proteini povezani sa specifičnim genomskim regijama, kao što su transkripcijski faktori na promotoru ili druga mjesta vezanja DNK, i eventualno definiranje cistrona. ChIP takođe ima za cilj da odredi specifičnu lokaciju u genomu sa kojom su povezane različite histonske modifikacije, što ukazuje na cilj modifikatora histona. ChIP je ključan za napredak u polju epigenomike i učenje više o epigenetičkim fenomenima.

Ukratko, konvencijski metod je sljedeći: DNK i povezani proteini na hromatinu u živim ćelijama ili tkivima su umreženi (ovaj korak je izostavljen u Native ChIP). Kompleksi DNK-protein (hromatin-protein) se zatim režu u fragmenate DNK od ~500 bp sonifikacijom ili digestijom pomoću nukleaza. Unakrsno povezani fragmenti DNK povezani sa proteinom(ima) od interesa se selektivno imunoprecipitiraju iz ćelijskih ostataka koristeći odgovarajuće antitijelo specifično za protein. Povezani fragmenti DNK se pročišćavaju i određuje se njihova sekvenca. Obogaćivanje specifičnih DNK sekvenci predstavlja regione na genomu sa kojima je protein od interesa povezan "in vivo".

Tipovi ChIP Postoje uglavnom dva tipa ChIP-a, koje se prvenstveno razlikuju u početnoj pripremi hromatina. Prvi koristi reverzibilno unakrsno-vezani hromatin srezan pomoću sonikacije koji se zove umreženi ChIP (XChIP). Nativni ChIP (NChIP) koristi prirodni hromatin srezan putem mikrokokusne nukleazne razgradnje.

Umreženo vezani ChIP (XChIP) Umreženi ChIP je uglavnom prikladan za mapiranje DNK mete transkripcijskih faktora ili drugih proteina povezanih s hromatinom i koristi reverzibilno unakrsno-povezani hromatin kao početni materijal. Sredstvo za reverzibilno umrežavanje može biti formaldehid ili UV svjetlost. Zatim se umreženi hromatin obično reže ultrazvukom, dajući fragmente dužine 300–1000 baznih parova (bp). Za smicanje hromatina korišteno je blago formaldehidno umrežavanje, praćeno digestijom puten nukleaza. Fragmenti hromatina od 400 – 500 bp pokazali su se pogodnim za ChIP testove jer pokrivaju dva do tri nukleosoma.

Ćelijski ostaci u pomaknutom lizatu se zatim uklanjaju sedimentacijom i kompleksi protein-DNK se selektivno imunoprecipitiraju upotrebom specifičnih antitijela na protein(e) od interesa. Antitijela se obično spajaju na agarozu, sefarozu ili magnetne kuglice. Alternativno, kompleksi hromatin-antitijelo mogu se selektivno zadržati i eluirati inertnim polimernim diskovima.Revolutionary solid state platform for chromatin immunopreciptation. Imunoprecipitirani kompleksi (tj. kompleks zrna–antitijelo–protein–ciljna sekvenca DNK) se zatim sakupljaju i ispiru kako bi se uklonio nespecifično vezani hromatin, preokreće se protein–DNK unakrsna veza i proteini se uklanjaju probavom proteinazom K. Verzija proteina od interesa sa oznakom epitopa ili biotinilacija in vivo mogu se koristiti umjesto antitijela na nativni protein od interesa.

DNK povezana s kompleksom se zatim pročišćava i identificira lančanom reakcijom polimeraze (PCR), mikronizovima (čIp-na-čip), molekulskim kloniranjem i sekvenciranjem ili direktnim visooprotočno sekvenciranje

Nativni ChIP (NChIP) Nativni ChIP je uglavnom pogodan za mapiranje DNK mete histonskih modifikatora. Općenito, prirodni hromatin se koristi kao početni hromatin. Dok se histoni omotaju oko DNK i formiraju nukleosome, oni su prirodno povezani. Zatim se hromatin smješta razgradnjom mikrokoknih nukleaza, koje cijepaju DNK po dužini povezivača, ostavljajući nukleosome netaknutim i osiguravajući fragmente DNK dužine od jednog (200bp) do pet nukleosoma (1000bp). Nakon toga, metode slične XChIP-u koriste se za čišćenje ćelijskih ostataka, imunoprecipitaciju proteina od interesa, uklanjanje proteina iz imunoprecipitiranog kompleksa i pročišćavanje i analizu DNK povezane s kompleksom.

Tabela 1: Prednosti i nedostaci NChIP i XChIP XChIP NChIP Prednosti Pogodno za faktore transkripcije ili bilo koje druge proteine povezane s hromatinom koji se slabo vezuju.Primjenjivo na sve organizme gdje je prirodni protein teško pripremiti Testabilna specifičnost antitelaBolja specifičnost antitijela kao ciljni protein prirodno netaknut Bolja efikasnost oporavka hromatina i proteina zbog bolje specifičnosti antitijela Nedostaci Neefikasan oporavak hromatina zbog poremećaja epitopa ciljnog proteina antitijelaMože uzrokovati lažno pozitivan rezultat zbog fiksacije prolaznih proteina na hromatinŠirok raspon veličine smicanja hromatina zbog nasumičnih rezova ultrazvukom. Obično nije prikladno za nehistonske proteineNukleosomi se mogu preurediti tokom probave

Ograničenja Testovi velikih razmjera koji koriste ChIP su izazovni uz korištenje intaktnih modelnih organizama. To je zato što se za svaki TF moraju generirati antitijela ili, alternativno, moraju se proizvesti transgeni modelni organizmi koji eksprimiraju TF označene epitopom. Istraživači koji proučavaju diferencijalne obrasce ekspresije gena u malim organizmima takođe se suočavaju sa problemima jer se geni eksprimiraju na niskim nivoima, u malom broju ćelija, u uskom vremenskom prozoru. ChIP eksperimenti ne mogu razlikovati različite TF izoforme (Izoforma proteina).

Također pogledajte Imunoprecipitacija DamID RIP-čip

Reference

Vanjski linkovi

EpigenomeNOE.com Chromatin Immunopreciptation (ChIP) on Unfixed Chromatin from Cells and Tissues to Analyze Histone Modifications Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) of Protein Complexes: Mapping of Genomic Targets of Nuclear Proteins in Cultured Cells

thumb|right|300px| Radni tok čipovanog sekvenciranja Hromatinska Imunoprecipitacija (ChIP) je tip imunoprecipitacija imunoprecipitacijske eksperimentalne tehnike koja se koristi za istraživanje interakcije između proteina i DNK u ćeliji. Cilj mu je utvrditi da li su specifični proteini povezani sa specifičnim genomskim regijama, kao što su transkripcijski faktori na promotoru ili druga mjesta vezanja DNK, i eventualno definiranje cistrona. ChIP takođe ima za cilj da odredi specifičnu lokaciju u genomu sa kojom su povezane različite histonske modifikacije, što ukazuje na cilj modifikatora histona. ChIP je ključan za napredak u polju epigenomike i učenje više o epigenetičkim fenomenima.

Ukratko, konvencijski metod je sljedeći: DNK i povezani proteini na hromatinu u živim ćelijama ili tkivima su umreženi (ovaj korak je izostavljen u Native ChIP). Kompleksi DNK-protein (hromatin-protein) se zatim režu u fragmenate DNK od ~500 bp sonifikacijom ili digestijom pomoću nukleaza. Unakrsno povezani fragmenti DNK povezani sa proteinom(ima) od interesa se selektivno imunoprecipitiraju iz ćelijskih ostataka koristeći odgovarajuće antitijelo specifično za protein. Povezani fragmenti DNK se pročišćavaju i određuje se njihova sekvenca. Obogaćivanje specifičnih DNK sekvenci predstavlja regione na genomu sa kojima je protein od interesa povezan "in vivo".

Tipovi ChIP Postoje uglavnom dva tipa ChIP-a, koje se prvenstveno razlikuju u početnoj pripremi hromatina. Prvi koristi reverzibilno unakrsno-vezani hromatin srezan pomoću sonikacije koji se zove umreženi ChIP (XChIP). Nativni ChIP (NChIP) koristi prirodni hromatin srezan putem mikrokokusne nukleazne razgradnje.

Umreženo vezani ChIP (XChIP) Umreženi ChIP je uglavnom prikladan za mapiranje DNK mete transkripcijskih faktora ili drugih proteina povezanih s hromatinom i koristi reverzibilno unakrsno-povezani hromatin kao početni materijal. Sredstvo za reverzibilno umrežavanje može biti formaldehid ili UV svjetlost. Zatim se umreženi hromatin obično reže ultrazvukom, dajući fragmente dužine 300–1000 baznih parova (bp). Za smicanje hromatina korišteno je blago formaldehidno umrežavanje, praćeno digestijom puten nukleaza. Fragmenti hromatina od 400 – 500 bp pokazali su se pogodnim za ChIP testove jer pokrivaju dva do tri nukleosoma.

Ćelijski ostaci u pomaknutom lizatu se zatim uklanjaju sedimentacijom i kompleksi protein-DNK se selektivno imunoprecipitiraju upotrebom specifičnih antitijela na protein(e) od interesa. Antitijela se obično spajaju na agarozu, sefarozu ili magnetne kuglice. Alternativno, kompleksi hromatin-antitijelo mogu se selektivno zadržati i eluirati inertnim polimernim diskovima.Revolutionary solid state platform for chromatin immunopreciptation. Imunoprecipitirani kompleksi (tj. kompleks zrna–antitijelo–protein–ciljna sekvenca DNK) se zatim sakupljaju i ispiru kako bi se uklonio nespecifično vezani hromatin, preokreće se protein–DNK unakrsna veza i proteini se uklanjaju probavom proteinazom K. Verzija proteina od interesa sa oznakom epitopa ili biotinilacija in vivo mogu se koristiti umjesto antitijela na nativni protein od interesa.

DNK povezana s kompleksom se zatim pročišćava i identificira lančanom reakcijom polimeraze (PCR), mikronizovima (čIp-na-čip), molekulskim kloniranjem i sekvenciranjem ili direktnim visooprotočno sekvenciranje

Nativni ChIP (NChIP) Nativni ChIP je uglavnom pogodan za mapiranje DNK mete histonskih modifikatora. Općenito, prirodni hromatin se koristi kao početni hromatin. Dok se histoni omotaju oko DNK i formiraju nukleosome, oni su prirodno povezani. Zatim se hromatin smješta razgradnjom mikrokoknih nukleaza, koje cijepaju DNK po dužini povezivača, ostavljajući nukleosome netaknutim i osiguravajući fragmente DNK dužine od jednog (200bp) do pet nukleosoma (1000bp). Nakon toga, metode slične XChIP-u koriste se za čišćenje ćelijskih ostataka, imunoprecipitaciju proteina od interesa, uklanjanje proteina iz imunoprecipitiranog kompleksa i pročišćavanje i analizu DNK povezane s kompleksom.

Tabela 1 Prednosti i nedostaci NChIP i XChIP XChIP NChIP Prednosti Pogodno za faktore transkripcije ili bilo koje druge proteine povezane s hromatinom koji se slabo vezuju.Primjenjivo na sve organizme gdje je prirodni protein teško pripremiti Testabilna specifičnost antitelaBolja specifičnost antitijela kao ciljni protein prirodno netaknut Bolja efikasnost oporavka hromatina i proteina zbog bolje specifičnosti antitijela Nedostaci Neefikasan oporavak hromatina zbog poremećaja epitopa ciljnog proteina antitijelaMože uzrokovati lažno pozitivan rezultat zbog fiksacije prolaznih proteina na hromatinŠirok raspon veličine smicanja hromatina zbog nasumičnih rezova ultrazvukom. Obično nije prikladno za nehistonske proteineNukleosomi se mogu preurediti tokom probave

Ograničenja Testovi velikih razmjera koji koriste ChIP su izazovni uz korištenje intaktnih modelnih organizama. To je zato što se za svaki TF moraju generirati antitijela ili, alternativno, moraju se proizvesti transgeni modelni organizmi koji eksprimiraju TF označene epitopom. Istraživači koji proučavaju diferencijalne obrasce ekspresije gena u malim organizmima takođe se suočavaju sa problemima jer se geni eksprimiraju na niskim nivoima, u malom broju ćelija, u uskom vremenskom prozoru. ChIP eksperimenti ne mogu razlikovati različite TF izoforme (Izoforma proteina).

Također pogledajte Imunoprecipitacija DamID RIP-čip

Reference

Vanjski linkovi

EpigenomeNOE.com Chromatin Immunopreciptation (ChIP) on Unfixed Chromatin from Cells and Tissues to Analyze Histone Modifications Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) of Protein Complexes: Mapping of Genomic Targets of Nuclear Proteins in Cultured Cells

thumb|right|300px| Radni tok čipovanog sekvenciranja