thumb|300px| Dijagram puteva popravka neusklađenosti DNK. Prvi stubac prikazuje popravak neusklađenosti kod eukariota, dok drugi prikazuje popravak kod većine bakterija. Treći stubac prikazuje popravak neusklađenosti specifičan u E. coli. thumb|right|Mikrografija ko gubitaka bojenja za MLH1 u kolorektumskom adenokarcinomu u skladu s popravkom neusklađenosti DNK (lijevo na slici) i benignom kolorektumskom sluznicom (desno od slike). Popravak neusklađenosti DNK (eng. Mismatch repair ; MMR) je sistem za prepoznavanje i popravljanje pogrešnih inesrcija, delecija i pogrešnog ugradnje baza koje može nastati tokom DNK replikacija i rekombinacija, kao i popravka nekih oblika oštećenja DNK.
Popravak neusklađenosti je specifičan za niti. Tokom sinteze DNK, novosintetizovani (kćerinski) lanac obično uključuje greške. Da bi se započela popravka, mehanizam za popravak neusklađenosti razlikuje novosintetizirani lanac od šablona (roditeljskog). Kod gram-negativnih bakterija, prolazna hemimetilacija razlikuje niti (roditeljska je metilirana, a kćerinska nije). Međutim, kod drugih prokariota i eukariota, tačan mehanizam nije jasan. Sumnja se da, kod eukariota, novosintetizovana DNK sa zaostalim lancem prolazno sadrži ureze (prije nego što bude zapečaćena DNK ligazom) i daje signal koji usmjerava neusklađene sisteme korekture na odgovarajući lanac. To implicira da ovi urrezi moraju biti prisutni u vodećim niti, a dokazi za to su nedavno pronađeni Recent work pokazuju da su urezi mjesta za RFC-ovisno učitavanje klizne spone za replikaciju, proliferirajući ćelijski jedarni antigen (PCNA), na način specifičan za orijentaciju, tako da je jedno lice proteina u obliku krofne suprotstavljeno prema kraju 3'-OH na urezu. Opterećena PCNA zatim usmjerava djelovanje MutLalpha endonukleaze lancu kćeri u prisustvu neusklađenosti i MutSalpha ili MutSbeta.
Svaki mutacijski događaj koji poremeti superheliksnu strukturu DNK nosi sa sobom potencijal da ugrozi genetičku stabilnost ćelije. Činjenica da su sistemi za otkrivanje oštećenja i popravke složeni koliko i sam mehanizam za replikaciju naglašava važnost koju je evolucija pridavala vjernosti strukture DNK.
Primjeri neusklađenih baza uključuju G/T ili A/C uparivanje (pogledajte popravak DNK). Nepodudarnosti su obično uzrokovane tautomerizacijom baza tokom replikacije DNK. Oštećenje se popravlja prepoznavanjem deformiteta uzrokovanog neusklađenošću, određivanjem predloška i lanca koji nije predložak, te izrezivanjem pogrešno ugrađene baze i zamjenom ispravnim nukleotidom. Proces uklanjanja uključuje više od samog neusklađenog nukleotida. Može se ukloniti nekoliko ili čak do hiljada parova baza novosintetizovanog lanca DNK.
Proteini za popravku neusklađenosti
Popravak neusklađenosti je visoko konzerviran proces od prokariota do eukariota. Prvi dokaz za popravku neusklađenosti dobijen je od S. pneumoniae (hexA i hexB gena). Naknadni rad na E. coli je identifikovao niz gena koji, kada se mutacijom inaktiviraju, uzrokuju hipermutabilne sojeve. Genetički proizvodi se, stoga, nazivaju "Mut" proteini i glavne su aktivne komponente sistema za popravku neusklađenosti. Tri od ovih proteina su neophodna u otkrivanju neusklađenosti i usmjeravanju mehanizma za popravku na njega: MutS, MutH i MutL (MutS je homolog HexA i MutL HexB).
MutS formira dimer (MutS2) koji prepoznaje neusklađenu bazu na lancu kćeri i vezuje mutiranu DNK. MutH se veže na hemimetiliranim mjestima duž ćerke DNK, ali je njegovo djelovanje latentno, aktivira se tek nakon kontakta s MutL dimerom (MutL2), koji vezuje MutS-DNK kompleks i djeluje kao posrednik između MutS2 i MutH, aktiviranje potonjeg. DNK se izvlači u petlju kako bi se tražilo najbliže d(GATC) metilacijsko mjesto neusklađenosti, koje bi moglo biti udaljeno do 1 kb. Nakon aktivacije kompleksom MutS-DNK, MutH odsijeca lanac kćer blizu hemimetiliranog mjesta. MutL regrutuje UvrD helikaza (DNK helikaza II) da razdvoji dva lanca sa specifičnim polaritetom od 3' do 5'. Cijeli MutSHL kompleks tada klizi duž DNK u smjeru nepodudaranja, oslobađajući lanac koji treba biti izrezan dok ide. Egzonukleaza prati kompleks i probavlja rep ss-DNK. Regrutovana egzonukleaza zavisi od toga na kojoj strani nepodudaranja MutH urezuje lanac – 5' ili 3'. Ako je urez koji je napravio MutH na 5' kraju neslaganja, koristi se ili RecJ ili ExoVII (oba 5' do 3' egzonukleaze). Međutim, ako je nadimak na 3' kraju neslaganja, koristi se egzoI (enzim od 3' do 5').
Čitav proces se završava nakon mjesta neslaganja - to jest, i samo mjesto i okolni nukleotidi su potpuno izrezani. Jednolančani jaz stvoren egzonukleazom može se zatim popraviti pomoću DNK-polimeraze III (uz pomoć proteina koji se vezuje za jedan lanac), koji koristi drugi lanac kao šablon, i konačno zapečaćen DNK ligazom. DNK-metilaza zatim brzo metilira kćerinski lanac.
MutS homolozi U eukariotima, MutS homolozi formiraju dva glavna heterodimera: Msh2/Msh6 (MutSα) i Msh2/Msh3 (MutSβ). MutSα put je prvenstveno uključen u supstituciju baze i popravku neusklađenosti male petlje. Put MutSβ također je uključen u popravku male petlje, pored popravke velike petlje (~10 nukleotidnih petlji). Međutim, MutSβ ne popravlja zamjene baza.
MutL homolozi
MutL takođe ima slabu aktivnost ATPaza (koristi ATP za potrebe kretanja). Formira kompleks sa MutS i MutH, povećavajući otisak MutS-a na DNK.
Međutim, procesnost (udaljenost na kojoj enzim može da se kreće duž DNK prije disociacije) UvrD je samo ~40-50 bp. Budući da udaljenost između ureza stvorenog MutH-om i neusklađenosti može u prosjeku ~600 bp, ako nije napunjen drugi UvrD, odmotani dio je tada slobodan da se ponovo uklapa u svoj komplementarni lanac, prisiljavajući proces da počne iznova. Međutim, uz asistenciju MutL-a, "stopa" UvrD opterećenja se znatno povećava. Dok procesnost (i upotreba ATP-a) pojedinačnih UvrD molekula ostaje ista, ukupni efekat na DNK je značajno pojačan; DNK nema šanse da se ponovo zamota, jer svaki UvrD odmota 40-50 bp DNK, disocira, a zatim je odmah zamijenjen drugim UvrD, ponavljajući proces. Ovo izlaže velike dijelove DNK probavi egzonukleazama, što omogućava brzo izrezivanje (i kasniju zamjenu) netačne DNK.
Eukarioti imaju pet MutL homologa označenih kao MLH1, MLH2, MLH3, PMS1 i PMS2. Oni formiraju heterodimere koji oponašaju MutL u E. coli. Ljudski homolozi prokariotskog MutL formiraju tri kompleksa koji se nazivaju MutLα, MutLβ i MutLγ. MutLα kompleks je napravljen od MLH1 i PMS2 podjedinica, MutLβ heterodimer je napravljen od MLH1 i PMS1, dok je MutLγ napravljen od MLH1 i MLH3. MutLα djeluje kao endonukleaza koja uvodi prekide lanca u lanac kćeri nakon aktivacije neusklađenošću i drugim potrebnim proteinima, MutSα i PCNA. Ovi prekidi lanca služe kao ulazne tačke za aktivnost egzonukleaze koja uklanja neusklađenu DNK. Uloge koje igraju MutLβ i MutLγ u popravljanju neusklađenosti su manje shvaćene.
MutH: endonukleaza u E. coli i Salmonela MutH je vrlo slaba endonukleaza koja se aktivira kada se veže za MutL (koji je i sam vezan za MutS). Ods9ieca nemetiliranu DNK i nemetilirani lanac hemimetilirane DNK, ali ne urezuje potpuno metiliranu DNK. Eksperimenti su pokazali da je popravak neusklađenosti slučajan ako nijedan lanac nije metiliran. Ova ponašanja su dovela do prijedloga da MutH određuje koja sekvenca sadrži neusklađenost. MutH nema eukariotski homolog. Njegovu endonukleaznu funkciju preuzimaju MutL homolozi, koji imaju specijaliziranu aktivnost 5'-3' egzonukleaze. Pristranost lanca za uklanjanje neusklađenosti iz novosintetizovane kćerke lanca kod eukariota može biti obezbijeđena slobodnim 3' krajevima Okazaki fragmenta u novom lancu stvorenom tokom replikacije.
PCNA β-klizna stezaljka
PCNA i β-klizna stezaljka povezana je sa MutSα/β i MutS, respektivno. Iako su prvi izvještaji sugerirali da PCNA-MutSα kompleks može poboljšati prepoznavanje neusklađenosti, nedavno je pokazano > da nema očigledne promjene u afinitetu MutSα za nepodudarnost u prisustvu ili odsustvu PCNA. Štaviše, mutanti MutSα koji nisu u stanju da stupe u interakciju sa PCNA in vitro pokazuju kapacitet da sprovedu prepoznavanje neusklađenosti i eksciziju neusklađenosti do nivoa blizu divljeg tipa. Takvi mutanti su defektni u reakciji popravljanja usmjerenoj prekidom lanca od 5', što sugerira po prvi put funkciju MutSα u koraku reakcije nakon ekscizije.
Klinički značaj
Naslijeđeni defekti u popravci neusklađenosti
Mutacije u ljudskim homolozima Mut proteina utiču na stabilnost genoma, što može dovesti do mikrosatelitske nestabilnosti (MSI), uključene u neke tipove raka kod ljudi. Konkretno, nasljedni nepolipni kolorektumski karcinomi (HNPCC ili Lynchov sindrom) pripisuju se štetnim varijantama zametne linije u genima koji kodiraju MutS i MutL homologe MSH2 i MLH1, koji su tako klasifikovani kao tumor supresorski geni. Jedan podtip HNPCC, Muir-Toreovog sindroma (MTS), povezan je s tumorima kože. Ako obje naslijeđene kopije (alela) MMR gena nose štetne genske varijante, to rezultira vrlo rijetkim i teškim stanjem: sindrom raka popravljanja neusklađenosti (ili nedostatak konstitucijske popravke neslaganja, CMMR-D), koji se manifestira kao višestruko pojave tumora u ranoj dobi, često debelog crijeva i tumor mozga.
Epigenetičko utišavanje gena za popravku neusklađenosti
Sporadični karcinomi sa nedostatkom popravke DNK samo rijetko imaju mutaciju gena za popravak DNK, ali umjesto toga imaju tendenciju da imaju epigenetičke promjene kao što je metilacija promotora koja inhibira ekspresiju gena za popravak DNK. Oko 13% kolorektumskih karcinoma ima nedostatak u popravci neusklađenosti DNK, obično zbog gubitka MLH1 (9,8%), ili ponekad MSH2, MSH6 ili PMS2 (svi ≤1.5%). Za većinu sporadičnih kolorektumskih karcinoma sa nedostatkom MLH1, nedostatak je nastao zbog metilacije promotora MLH1. Ostali tipovi karcinoma imaju veću učestalost gubitka MLH1 (pogledajte tabelu ispod), što je opet u velikoj mjeri posljedica metilacija promotora gena MLH1. Različiti epigenetički mehanizam koji leži u osnovi nedostataka MMR može uključivati prekomjernu ekspresiju mikroRNK, naprimjer miR-155 nivoi u obrnutoj korelaciji sa ekspresijom MLH1 ili MSH2 kod kolorektumskog karcinoma.
+Kanceri s nedostatkom MLH1Tip rakaUčestalost deficita kod rakaUčestalost nedostataka u susjednom defektu polja32%24%-28%Želudac (tumori foveolskog tipa) 74%71% Želudac u dolini Kašmira visoke incidencije 73%20%Jednjački73%27% Karcinom skvamoznih ćelija glave i vrata (HNSCC)31%-33%20%-25%Karcinom pluća nemalih ćelija (NSCLC)69%72%Kolorektumski10%
MMR kvarovi u defektima na terenu
defekt polja (kancerizacija polja) je područje epitela koje je preduslovljeno epigenetičkim ili genetičkim promjenama, što ga predisponira za razvoj raka. Kako je istakao Rubin "...postoje dokazi da se više od 80% somatskih mutacija pronađenih u mutatorskom fenotipu ljudskih kolorektumsih tumora javlja prije početka terminalne klonske ekspanzije." Slično tome, Vogelstein et al. ističu da se više od polovine somatskih mutacija identifikovanih u tumorima dogodilo u preneoplazijskoj fazi (u defektu polja), tokom rasta naizgled normalnih ćelija.
Nedostaci MLH1 bili su česti kod defekta polja (histološki normalnog tkiva) koji okružuju tumore; vidi gornju tabelu. Epigenetički utišani ili mutirani MLH1 vjerovatno ne bi dao selektivnu prednost matičnoj ćeliji, međutim, to bi izazvalo povećane stope mutacija, a jedan ili više mutiranih gena može dati ćeliji selektivnu prednost. Deficitarni gen MLH1 bi se tada mogao nositi kao selektivno skoro neutralan putnički (autostoperski) gen kada mutirana matična ćelija generira prošireni klon. Kontinuirano prisustvo klona s epigenetićki potisnutim MLH1 nastavilo bi stvarati daljnje mutacije, od kojih bi neke mogle proizvesti tumor.
MMR komponente kod ljudi