thumb|right|Trostruka struktura DNK. Strelice idu od kraja 5' do kraja 3' d. (1BWG) Trolančana DNK (također poznata kao H-DNK ili tripleksna-DNK) je struktura DNK u kojoj se tri oligonukleotida vijugaju jedan oko drugog i formiraju trostruku spiralu. U trolančanoj DNK, treći lanac se vezuje za DNK oblika B-DNK (preko Watson-Crickovog uparivanje baza) u dvostruku spiralu formiranjem Hoogsteenovih baznih parova ili obrnutih Hoogsteenovih vodikovih veza.
Struktura 300px|thumb|right|Prostorna strukturta trolančane DNK Primjeri trolančane DNK pronađeni su u prirodnim izvorima sa potrebnim strukturnim elementima, naprimjer u satelitskoj DNK.Fowler, R.F.; Skinner, D. M. (1986-07-05). "Eukariotska DNK divergira na dugom i složenom pirimidin:purinom traktu koji može usvojiti izmijenjene konformacije." The Journal of Biological Chemistry. 261 (19): 8994–9001. PMID 3013872Fowler, R. F.; Skinner, D. M. (1986-07-05). "Eukaryotic DNA diverges at a long and complex pyrimidine:purine tract that can adopt altered conformations". The Journal of Biological Chemistry. 261 (19): 8994–9001. PMID 3013872.
Uparivanje Hoogsteenovih baza Timinska (T) nukleobaza može se vezati za Watson–Crickovo uparivanje baza T-A formiranjem Hoogsteenove vodikove veze. Timinski vodik se veže sa adenozinom (A) originalne dvolančane DNK, kako bi stvorio T-A*T bazni triplet.
Međumolekulske i unutarmolekulske interakcije thumb|Osnovne trijade H-DNK tripleksa: CG*G, TA*A, TA*T, na CG*A+.|260x260px Postoje dvije klase tripleksne DNK: međumolekulske i unutarmolekulske formacije. Međumolekulski tripleks se odnosi na formiranje tripleksa između dupleksa i drugačijeg (trećeg) lanca DNK. Treći lanac može biti ili iz susjednog hromosoma ili oligonukleotida koji formira tripleks (TFO). Unutarmolekulski tripleks DNK formira se od dupleksa sa homopurinom i homopirimidinskim lancima sa simetrijom ponavljanja kao slika u ogledalu. Stepen uvijanja superspirala u DNK utiče na količinu formiranja unutarmolekulskog tripleksa koja se javlja. Postoje dva različita tipa unutarmolekulske tripleksne DNK: H-DNK i H*-DNK. Formiranje H-DNK se stabilizuje u kiselim uslovima i u prisustvu divalentnih kationa, kao što je Mg2+. U ovoj konformaciji, homopirimidinski lanac u dupleksu se savija unazad, kako bi se vezao za purinski lanac na paralelan način. Osnovni trolanci koji se koriste za stabilizaciju ove konformacije su T-A*T i C-G*A+. Citozin ove bazne trijade treba biti protoniran da bi se formirao ovaj unutarmolekulski trostruki heliks, zbog čega se ova konformacija stabilizuje u kiselim uslovima. H*-DNK ima povoljne uslove za formiranje pri neutralnom pH i u prisustvu dvovalentnih kationa. Ova unutsatarmolekulska konformacija formira se od vezivanja homopurinskog i purinskog lanca dupleksa na antiparalelni način . Stabiliziran je baznim tripletima T-A*A i C-G*G.
Funkcija
Oligonukleotidno formiranje tripleksa (TFO) TFO su kratki (≈15-25 nt) lanci nukleinske kiseline koji se vezuju u glavni žlijeb dvolančane DNK, kako bi formirali unutarmolekulake tripleksne strukture DNK. Postoje neki dokazi da su oni također sposobni modulirati aktivnost gena in vivo. U peptidnoj nukleinskoj kiselini (PNA), šećernofosfatna okosnica DNK zamijenjena je okosnicom nalik proteinu. PNA formiraju P-petlje dok su u interakciji sa dupleksom DNK, formirajući tripleks sa jednim lancem DNK, dok istiskuju drugi. Pretpostavlja se da se pod RecA proteinom u toku homologne rekombinacije formiraju vrlo neobične rekombinacije ili paralelne triplekse ili R-DNK.
TFO se specifično vezuju za homopurin-homopirimidinske regije koje su često uobičajene u promotorskim i intronskim sekvencama gena, utičući na ćelijsku signalizaciju. TFO mogu inhibirati transkripciju, vezujući se sa visokom specifičnošću za spiralu DNK, čime blokiraju vezivanje i funkciju faktora transkripcije za određene sekvence. Uvođenjem TFO-a u ćeliju (transfekcijom ili drugim sredstvima), može se kontrolisati ekspresija određenih gena. Ova aplikacija ima nove implikacije u mutagenezi specifičnoj za mjesto i genskoj terapiji. U ljudskim ćelijama raka prostate, transkripcijski faktor Ets2 je pretjerano izražen i smatra se da pokreće rast i preživljavanje ćelija u takvom višku. Carbone et al. dizajnirali su TFO specifičan za sekvencu za Ets2 promotorsku sekvencu koja je smanjila ekspresiju gena i dovela do usporavanja ćelijski rast i smrti ćelije. Changxian et al. su također predstavili TFO koji cilja na promotorsku sekvencu bcl-2, gena koji inhibira apoptozu.
Uočena inhibicija transkripcije također može imati negativne zdravstvene efekte kao što je njena uloga u recesivnom, autosomnom genu za Friedreichovu ataksiju. Kod Fredrickove ataksije, formiranje tripleksa DNK narušava ekspresiju intron 1 gena FXN. To dovodi do degeneracije nervnog sistema i kičmene moždine, ometajući kretanje udova.] Za borbu protiv ove tripleksne nestabilnosti, pokazalo se da proteini za popravku ekscizijom nukleotida (NER) prepoznaju i popravljaju trolančane DNK strukture, vraćajući potpunu dostupnost prethodno inhibiranog i nestabilnog gena. thumb|Struktura PNA. PDB ID: 1PNN Proteopedia
Peptidne nukleinske kiseline (PNA) Peptidne nukleinske kiseline su sintetski oligonukleotidi koji se odupiru degradaciji proteazama i koriste se za induciranje popravke u regijama formiranja tripleksa specifičnih za mjesto na genomskim mjestima DNK. PNA su u stanju da se vežu sa visokim afinitetom i specifičnošću sekvence za komplementarnu sekvencu DNK putem Watson-Crickovog uparivanje baza i mogu da formiraju trostruke spirale kroz paralelne orijentacije Hoogsteenove veze sa PNA okrenutim ka 5' -kraju DNK lanca. PNA-DNK tripleks je stabilan jer se PNA sastoje od neutralno nabijene pseudopeptidne kičme koja se veže za sekvencu dvolančane DNK (dsDNA).. Slično kao homopirimidin u TFO, homopirimidin u PNA je u stanju da formira vezu sa komplementarnim homopurinom u ciljnoj sekvenci dsDNK. Ovi analozi DNK su u stanju da se vežu za dsDNK, iskorišćavanjem ambijentnih uslova DNK i različitih načina predviđanja prepoznavanja. Ovo se razlikuje od TFO-a koji se vezuju kroz glavni žlijeb prepoznavanjem dsDNK.
Jedan od korištenih načina predviđanja prepoznavanja je dupleksna invazija. Unutar mješovitog A–T/G–C dsDNK, sekvenca je ciljana od strane par pseudokomplementarnih (pc) PNA, koji su u stanju da se vežu za dsDNK dvostrukom invazijom kroz istovremeno stvaranje diaminopurina (D) i tiouracila (Us) koji zamjenjuju adenin i timin. pc PNA par formira D–T i Us–A i G–C ili C–G Watson-Crickovu uparenu spiralu PNA-DNK sa svakim od komplementarnih lanaca DNK. Drugi oblik prepoznate dupleksne invazije na ciljanu sekvencu može se pojaviti u dsDNK koja sadrži mješovite sekvence T–C. Ovaj oblik dupleksne invazije postiže se komplementarnom sekvencom homopurinskih PNA oligomera. Ovaj tripleks je formiran od hibrida PNA-DNK koji se vezuje antiparalelno s komplementarnom sekvencom DNK i rezultira pomjerenim nekomplementarnim lancem DNK.
Dodatno, PNA se može modificirati tako da se formiraju tripleksne strukture "zatezanja" na ciljnom mjestu. Jedan tip formirane "stezaljke" je bis-PNA struktura, u kojoj se dvije molekule PNA drže zajedno fleksibilnim linkerom kao što je 8-amino-3,6-dioksaoktanska kiselina (O). Bis-PNA struktura formira PNA-DNK-PNA tripleks na ciljnom mjestu, gdje jedan lanac formira Watson-Crickove bazne parove sa DNK u antiparalelnoj orijentaciji, a drugi lanac formira Hoogsteenove bazne parove sa homopurinskim lancem DNK u DNK-PNA dupleks. Repna stezaljka PNA (tcPNA) je također drugi oblik tripleksne stezaljke koja se također može formirati. TcPNA sadrže produženi rep od 5-10 bp koji formira PNA/DNK dupleks pored PNA-DNK-PNA "stezaljke". Ovo omogućava preciznije vezivanje PNA, bez potrebe za rastezanjem homopirimidina/piridina. Pokazalo se da ove strukture stezanja imaju visok afinitet i specifičnost. Dodavanje ostataka lizina na jedan ili oba kraja PNA može se koristiti za povećanje ćelijske apsorpcije i vezivanja.
Genetička regulacija Trolančana DNK uključena je u regulaciju nekoliko gena. Naprimjer, gen c-myc je ekstenzivno mutiran kako bi se ispitala uloga koju tripleksna DNK, naspram linearne sekvence, ima u regulaciji gena. C-myc promotorski element, zvani element osjetljiv na nukleazu ili NSE, može formirati tandemske unutarmolekulske triplekse tipa H-DNK i ima motiv repetitivne sekvence (ACCCTCCCC)4. Mutirani NSE je ispitan na transkripcijsku aktivnost i na njegovu sposobnost formiranja intra- i intermolekulskog tripleksa. Transkripcia aktivnost mutantnih NSE može se predvidjeti sposobnošću elementa da formira H-DNK, a ne brojem ponavljanja, položajem ili brojem mutantnih baznih parova. DNK stoga može biti dinamički učesnik u transkripciji c-myc gena.
Ekspresija gena Prema nekoliko objavljenih članaka, H-DNK ima sposobnost da reguliše ekspresiju gena u zavisnosti od faktora kao što su lokacija i sekvence u blizini. Iako su intergenski regioni prokariotskog genoma pokazali niske tragove H-DNK ili tripleks motiva koji se javljaju u prirodi, pokazalo se da su strukture H-DNK zastupljenije u eukariotskom genomu. Pokazalo se da je H-DNK posebno zastupljena u ćelijama sisara, uključujući ljude (1 na svakih 50.000 bp). Genske sekvence uključene u regulaciju gena obično se nalaze u promotorskoj regiji eukariotskog genoma.
Shodno tome, region promotora pokazao je sposobnost da formira H-DNK sa višom frekvencijom. Bioinformatička analiza genoma S. cerevisiae uočila je pojavu H-DNK i drugih motiva trostruke DNK u četiri organizaciona regiona: introni, egzoni, promotorski regioni i razni regioni. Bioinformatika je prikazala ukupno 148 mogućih struktura H-DNK ili tripleta DNK. Promotorska regija je imala višu frekvenciju sa 71 trostrukom strukturom, dok su egzoni činili 57 triplatnih struktura, a introni i ostalo 2 i 18 struktura.
Studije in vitro i in vivo ekspresije eukariotskog genoma rezultirale su jednim od tri rezultata: nadregulacija, podregulacija, ili bez promjene u prisustvu motiva H-DNK. Kato et al. prijavili su ekspresiju pojačane regulacije lacZ, kada je H-DNK uveden u promotor B-laktamaze. S druge strane, slična studija (Brachmachari et al.) prijavila je da nema statistički značajne inhibicije reporterskog gena lacZ kada je H-DNK umetnuta u genom COS sisarskih ćelija. Iako studije sugeriraju regulaciju H-DNK, mehanizam se još uvijek istražuje. Potaman et al povezuju mehanizam regulacije gena sa interakcijama između H-DNK i TATA-kutije koja se nalazi u promotorskom regionu Na,K-ATPaze. U formacijama H-DNK, u blizini TATA-kutije, struktura H-DNK destabilizira T-A veze neophodne za transkripciju. Interferencija sa TATA-kutijom inhibira transkripcijski mehanizam i inicijaciju transkripcije koja ometa ekspresije gena. Ostali mehanizmi povezani sa genomskom ekspresijom genetičke sekvence u prisustvu H-DNK uključuju TFO. Studije in vitro istakle su smanjenje ekspresija gena u prisustvu TFO u sisarskim ćelijama. Drugi mogući mehanizam predstavili su Valentin et al., sugerirajući da 13-merni A–G motiv oligonukleotidni tripleksni kompleks (TFO kompleks) smanjuje transkripciju iRNK putem kompetitivne inhibicije. Direktna inhibicija ekspresija gena iz H-DNK ključna je za mutagenezu, inhibiciju replikacije, pa čak i rekombinaciju DNK u genomu.
Rekombinacija thumb|359x359px|A) Kristalna struktura RecA-DNK i formiranje D-petlje B) H-DNK struktura RecA, PDB: 7JY7