Proteinsko inženjerstvo je proces razvoja korisnih ili vrijednih proteina kroz dizajn i proizvodnju neprirodnih peptida, često mijenjanjem sekvenci aminokiselina, koje se nalaze u prirodi. To je relativno mlada disciplina, s mnogo istraživanja u razumijevanju savijanja proteina i prepoznavanju principa dizajna proteina. Koristi se za poboljšanje funkcije mnogih enzima za industrijsku katalizu..

Postoje dvije opšte strategije za inženjerstvo proteina: racionalni dizajn proteina i usmjerena evolucija. Ove metode se međusobno ne isključuju; istraživači će često primjenjivati obje. U budućnosti, detaljnije poznavanje struktura proteina i funkcije, te napredak u visokopropusnom skriningu, mogu značajno proširiti mogućnosti proteinskog inženjerstva. Na kraju, čak i neprirodne aminokiseline mogu biti uključene, putem novijih metoda, kao što je prošireni genetički kod, koje omogućavaju kodiranje novih aminokiselina u genetičkom kodu. Primjene u brojnim oblastima, uključujući medicinu i industrijsku bioprocesu, su ogromne i brojne.

Pristupi

Racionalni dizajn

U racionalnom dizajnu proteina, naučnik koristi detaljno znanje o strukturi i funkciji proteina kako bi napravio željene promjene. Općenito, ovo ima prednost što je jeftino i tehnički jednostavno, budući da su metode usmjerene mutageneze dobro razvijene. Međutim, njegov glavni nedostatak je što detaljno strukturno znanje proteina često nije dostupno, a čak i kada je dostupno, može biti vrlo teško predvidjeti efekte različitih mutacija, jer strukturne informacije najčešće pružaju statičnu sliku strukture proteina. Međutim, programi poput Folding@home i Foldit koristili su tehnike sređivanja kako bi dobili uvid u motive savijanja proteina.

Algoritmi za računarski dizajn proteina algoritmi nastoje identificirati nove aminokiselinske sekvence koje imaju nisku energiju kada se savijaju u unaprijed određenu ciljnu strukturu. Iako je prostor konformacije sekvence koji treba pretražiti velik, najizazovniji zahtjev za računarski dizajn proteina je brza, ali tačna energetska funkcija koja može razlikovati optimalne sekvence od sličnih suboptimalnih.

Višestruko poravnanje sekvenci Bez strukturnih informacija o proteinu, analiza sekvenci je često korisna u razjašnjavanju informacija o proteinu. Ove tehnike uključuju poravnanje ciljnih proteinskih sekvenci s drugim srodnim proteinskim sekvencama. Ovo poravnanje može pokazati koje su aminokiseline očuvane između vrsta i važne su za funkciju proteina. Ove analize mogu pomoći u identifikaciji aminokiselinskih vrućih tačaka koje mogu poslužiti kao ciljna mjesta za mutacije. Višestruko poravnanje sekvenci koristi baze podataka kao što su PREFAB, SABMARK, OXBENCH, IRMBASE i BALIBASE kako bi unakrsno povezao ciljne proteinske sekvence s poznatim sekvencama. Tehnike višestrukog poravnavanja sekvenci navedene su u nastavku. Ova metoda započinje izvođenjem parnog poravnanja sekvenci korištenjem metoda k-torka ili Needleman-Wunschovog algoritma. Ove metode izračunavaju matricu koja prikazuje parnu sličnost među parovima sekvenci. Rezultati sličnosti se zatim transformiraju u rezultate udaljenosti koji se koriste za izradu vodičkog stabla korištenjem metode spajanja susjeda. Ovo vodičko stablo se zatim koristi za postizanje višestrukog poravnanja sekvenci.

Klustal omega Ova metoda je sposobna poravnati do 190.000 sekvenci korištenjem k-torke. Sljedeće sekvence se grupišu korištenjem metoda mBed i k-prosjeka. Vodičko stablo se zatim konstruira korištenjem metode UPGMA koju koristi HH align paket. Ovo vodičko stablo se koristi za generiranje višestrukih poravnanja sekvenci.

MAFFT Ova metoda koristi brzu Fourierovu transformaciju (FFT) koja pretvara aminokiselinske sekvence u sekvencu sastavljenu od vrijednosti volumena i polarnosti za svaki aminokiselinski ostatak. Ova nova sekvenca se koristi za pronalaženje homolognih regija.

K-Align Ova metoda koristi Wu-Manberov algoritam za približno podudaranje stringova za generiranje višestrukih poravnanja sekvenci.

Višestruko poređenje sekvenci pomoću logaritamskog očekivanja (MUSCLE) Ova metoda koristi Kmerove i Kimurine udaljenosti za generiranje višestrukih poravnanja sekvenci.

T-Coffee Ova metoda koristi funkcije cilja konzistentnosti zasnovane na stablu za evoluciju poravnanja. Pokazalo se da je ova metoda 5–10% preciznija od Clustal W.

Koevolucijska analiza Koevolucijska analiza je također poznata kao korelirana mutacija, kovarijacija ili kosupstitucija. Ova vrsta racionalnog dizajna uključuje recipročne evolucijske promjene na evolucijski interagirajućim lokusima. Općenito, ova metoda počinje generiranjem kuriranog višestrukog poravnanja sekvenci za ciljnu sekvencu. Ovo poravnanje se zatim podvrgava ručnom poboljšanju koje uključuje uklanjanje sekvenci s velikim jazovima, kao i sekvenci s niskim identitetom sekvence. Ovaj korak povećava kvalitet poravnanja. Zatim se ručno obrađeno poravnanje koristi za daljnja koevolucijska mjerenja korištenjem različitih algoritama koreliranih mutacija. Ovi algoritmi rezultiraju matricom bodovanja koevolucije. Ova matrica se filtrira primjenom različitih testova značajnosti kako bi se izdvojile značajne vrijednosti koevolucije i uklonila pozadinska buka. Koevolucijska mjerenja se dalje evaluiraju kako bi se procijenile njihove performanse i strogost. Konačno, rezultati ove koevolucijske analize su eksperimentalno validirani.

Strukturno predviđanje De novo generisanje proteina ima koristi od poznavanja postojećih proteinskih struktura. Ovo znanje o postojećoj proteinskoj strukturi pomaže u predviđanju novih proteinskih struktura. Metode za predviđanje proteinske strukture spadaju u jednu od četiri sljedeće klase: ab initio, metode zasnovane na fragmentima, modeliranje homologije i navojno povezivanje proteina.

Ab initio Ove metode uključuju slobodno modeliranje bez korištenja bilo kakvih strukturnih informacija o šablonu. Ab initio metode imaju za cilj predviđanje nativnih struktura proteina koje odgovaraju globalnom minimumu njihove slobodne energije. Neki primjeri ab initio metoda su AMBER, GROMOS, GROMACS, CHARMM, OPLS i ENCEPP12. Opći koraci za ab initio metode počinju geometrijskim prikazom proteina od interesa. Zatim se razvija model funkcije potencijalne energije za protein. Ovaj model se može kreirati korištenjem potencijala molekularne mehanike ili potencijalnih funkcija izvedenih iz strukture proteina. Nakon razvoja modela potencijala, na protein se primjenjuju tehnike pretraživanja energije, uključujući molekularno-dinamičke simulacije, Monte Carlo simulacije i genetske algoritme.

Zasnovano na fragmentima Ove metode koriste informacije iz baze podataka o strukturama kako bi se homologne strukture uparile sa kreiranim proteinskim sekvencama. Ove homologne strukture se sastavljaju kako bi se dobile kompaktne strukture, korištenjem postupaka bodovanja i optimizacije, s ciljem postizanja najnižeg rezultata potencijalne energije. Web serveri za informacije o fragmentima su I-TASSER, ROSETTA, ROSETTA @ home, FRAGFOLD, CABS fold, PROFESY, CREF, QUARK, UNDERTAKER, HMM i ANGLOR. Modeliranje homologije Ove metode se zasnivaju na homologiji proteina. Ove metode su također poznate kao komparativno modeliranje. Prvi korak u modeliranju homologije je općenito identifikacija sekvenci šablona poznate strukture koje su homologne upitnoj sekvenci. Zatim se upitna sekvenca poravnava sa sekvencom predloška. Nakon poravnanja, strukturno očuvane regije se modeliraju korištenjem strukture šablona. Nakon toga slijedi modeliranje bočnih lanaca i petlji koje se razlikuju od predloška. Konačno, modelirana struktura prolazi kroz pročišćavanje i procjenu kvaliteta. Serveri koji su dostupni za podatke modeliranja homologije navedeni su ovdje: SWISS MODEL, MODELLER, ReformAlign, PyMOD, TIP-STRUCTFAST, COMPASS, 3d-PSSM, SAMT02, SAMT99, HHPRED, FAGUE, 3D-JIGSAW, META-PP, ROSETTA i I-TASSER.

Proteinsko uvođenje u sekvence Proteinsko uvođenje u sekvence može se koristiti kada se ne može pronaći pouzdan homolog za upitnu sekvencu. Ova metoda počinje dobijanjem upitnog niza i biblioteke šablonskih struktura. Zatim se upitni niz uvodi u nizove poznatih struktura predložaka. Ovi kandidatski modeli se boduju pomoću funkcija bodovanja. Boduju se na osnovu modela potencijalne energije i upitnog i sekvence predloška. Zatim se odabire podudaranje sa modelom sa najnižom potencijalnom energijom. Metode i serveri za preuzimanje podataka o nitima i izvođenje proračuna navedeni su ovdje: GenTHREADER, pGenTHREADER, pDomTHREADER, ORFEUS, PROSPECT, BioShell-Threading, FFASO3, RaptorX, HHPred, LOOPP server, Sparks-X, SEGMER, THREADER2, ESYPRED3D, LIBRA, TOPITS, RAPTOR, COTH, MUSTER.

Za više informacija o racionalnom dizajnu pogledajte usmjerena mutageneza na mjestu.

Multivalentno vezivanje

Multivalentno vezivanje se može koristiti za povećanje specifičnosti i afiniteta vezivanja putem efekata avidnosti. Prisustvo više domena vezivanja u jednoj biomolekuli ili kompleksu povećava vjerovatnoću da se dogode druge interakcije putem pojedinačnih događaja vezivanja. Avidnost ili efektivni afinitet mogu biti mnogo veći od zbira pojedinačnih afiniteta, pružajući isplativ i vremenski efikasan alat za ciljano vezivanje.

Multivalentni proteini Multivalentne proteine je relativno lako proizvesti posttranslacijskim modifikacijama ili umnožavanjem sekvence DNK koja kodira protein. Glavna prednost multivalentnih i multispecifičnih proteina je ta što mogu povećati efektivni afinitet za metu poznatog proteina. U slučaju nehomogenog cilja, korištenje kombinacije proteina, što rezultira multispecifičnim vezivanjem, može povećati specifičnost, što ima visoku primjenjivost u proteinskoj terapiji. Najčešći primjer multivalentnog vezivanja su antitijela, a postoje opsežna istraživanja za bispecifična antitijela. Primjena bispecifičnih antitijela pokriva širok spektar koji uključuje dijagnozu, snimanje, profilaksu i terapiju.

Usmjerena evolucija

U usmjerenoj evoluciji, slučajna mutageneza, npr. putem PCR-a sklonog greškama ili mutageneze zasićenja sekvence, primjenjuje se na protein, a režim selekcije se koristi za odabir varijanti koje imaju željene osobine. Zatim se primjenjuju daljnji krugovi mutacije i selekcije. Ova metoda oponaša prirodnu evoluciju i, općenito, daje superiorne rezultate u odnosu na racionalni dizajn. Dodatni proces, nazvan miješanje DNK, miješa i spaja dijelove uspješnih varijanti kako bi se dobili bolji rezultati. Takvi procesi oponašaju rekombinaciju koja se prirodno javlja tokom seksualne reprodukcije. Prednosti usmjerene evolucije su u tome što ne zahtijeva prethodno strukturno znanje proteina, niti je potrebno predvidjeti kakav će učinak imati određena mutacija. Zaista, rezultati eksperimenata usmjerene evolucije često su iznenađujući po tome što su željene promjene često uzrokovane mutacijama za koje se nije očekivalo da će imati neki učinak. Nedostatak je što zahtijevaju visokopropusni skrining, što nije izvodljivo za sve proteine. Velike količine rekombinantne DNK moraju se mutirati, a produkti se moraju pregledati na željene osobine. Veliki broj varijanti često zahtijeva skupu robotsku opremu za automatizaciju procesa. Nadalje, ne mogu se sve željene aktivnosti lako pregledati.