thumb|270px thumb|Ovdje je prikazan dijagram u četiri koraka koji prikazuje upotrebu pojačivača. Unutar ove DNK sekvence, protein(i) poznat(i) kao transkripcijski faktor(i) vežu se za pojačivač i povećavaju aktivnost promotora. U genetici, pojačivač ili pojačavač je kratka (50–1500 bp) regija DNK koja se može vezati za proteine (aktivator) kako bi se povećala vjerovatnoća da će se dogoditi transkripcija određenog gena. Ovi proteini se obično nazivaju transkripcijski faktori. Pojačivači su cis–djelujući. Mogu se nalaziti do 1 Mbp (1.000.000 bp) od gena, uzvodno ili nizvodno od početnog mjesta. U ljudskom genomu postoje stotine hiljada pojačivača. Nađeni su i kod eukariota i kod prokariota. Aktivni pojačivači se obično transkribiraju kao pojačivači ili regulatorne nekodirajuće RNK, čiji nivoi ekspresije koreliraju s nivoima iRNK ciljnih gena.
Prvo otkriće eukariotskog pojačivača bilo je u genu imunoglobulinskog teškog lanxa u 1983. Ovaj pojačivač, smješten u velikom intronu, pružio je objašnjenje za transkripcijsku aktivaciju preuređenih promotora Vh gena, dok su nepreuređeni Vh promotori ostali neaktivni. U posljednje vrijeme je pokazano da su pojačivači uključeni u određena medicinska stanja, naprimjer, mijelosupresija. Od 2022. godine, naučnici koriste vještačku inteligenciju za dizajniranje sintetskih pojačivača i primjenjuju ih u životinjskim sistemima, prvo u ćelijskoj liniji, i godinu dana kasnije također in vivo.
Lokacije U eukariotskim ćelijama, struktura hromatinskog kompleksa DNK je presavijena na način koji funkcionalno oponaša superspiralno stanje karakteristično za prokariotsku DNK, tako da iako pojačivač DNK može biti linearno udaljen od gena, prostorno je blizu promotoru i genu. To mu omogućava interakciju sa općim transkripcijskim faktorima i RNK-polimerazom II. Isti mehanizam važi i za utišivače u eukariotskom genomu. Prigušivači su antagonisti pojačivača koji, kada se vežu za svoje odgovarajuće transkripcijske faktore koji se nazivaju represori, potiskuju transkripciju gena. Prigušivači i pojačivači mogu biti u neposrednoj blizini jedan drugog ili čak mogu biti u istoj regiji, a razlikuju se samo po transkripcijskom faktoru za koji se regija veže.
Pojačivač se može nalaziti uzvodno ili nizvodno od gena koji reguliše. Nadalje, pojačivač ne mora biti smješten blizu mjesta transkripcijske inicijacije da bi uticao na transkripciju, jer je pronađeno da se neki nalaze nekoliko stotina hiljada baznih parova uzvodno ili nizvodno od početnog mjesta. Pojačivači ne djeluju na samu promotorsku regiju, već su vezani aktivatorskim proteinima, što je prvi put pokazano in vivo eksperimentima kompeticije.[ Nakon toga, molekularne studije su pokazale direktne interakcije s transkripcijskim faktorima i kofaktorima, uključujući medijatorski kompleks, koji regrutuje polimerazu II i opće transkripcijske faktore koji zatim počinju transkripciju gena. Pojačivači se također mogu naći unutar introna. Orijentacija pojačivača može čak biti obrnuta bez uticaja na njegovu funkciju; osim toga, pojačivač se može izrezati i umetnuti negdje drugdje u hromosomu, a i dalje uticati na transkripciju gena. To je jedan od razloga zašto introni polimorfizmi mogu imati efekte iako nisu translatirani. Pojačivači se također mogu naći u egzonskoj regiji nepovezanog gena i mogu djelovati na gene na drugom hromosomu.
Pojačivači su vezani za p300-CBP i njihova lokacija se može predvidjeti ChIP-seq u odnosu na ovu porodicu koaktivatora.
Uloga u ekspresiji gena thumb|500px| Regulacija transkripcije kod sisara. Aktivna regulatorna regija DNK pojačivača omogućava interakciju sa promotorskom regijom DNK svog ciljnog gena, formiranjem hromosomske petlje. Ovo može pokrenuti sintezu informacijske RNK (iRNK) putem RNK-polimeraze II (RNKP II) vezane za promotor na mjestu početka transkripcije gena. Petlja je stabilizirana jednim arhitektonskim proteinom usidrenim za pojačivač i jednim usidrenim za promotor, a ovi proteini su spojeni i formiraju dimer (crveni cik-cak). Specifični regulatorni transkripcijski faktori vežu se za motive DNK sekvence na pojačivaču. Opći transkripcijski faktori vežu se za promotor. Kada se transkripcijski faktor aktivira signalom (ovdje označeno kao fosforilacija. prikazana malom crvenom zvjezdicom na transkripcijskom faktoru na pojačivaču), pojačivač se aktivira i sada može aktivirati svoj ciljni promotor. Aktivni pojačivač se transkribira na svakom lancu DNK u suprotnim smjerovima putem vezanih RNAP II. Medijator (kompleks koji se sastoji od oko 26 proteina u interagirajućoj strukturi) prenosi regulatorne signale od transkripcijskih faktora vezanih za DNK pojačivača do promotora.
Ekspresija gena kod sisara regulirana je mnogim cis-regulatornim elementima, uključujući jedarne promotore i proksimalne elemente promotora koji se nalaze u blizini transkripcije gena. Jedarni promotori su dovoljni za usmjeravanje inicijacije transkripcije, ali općenito imaju nisku baznu aktivnost. Ostali važni cis-regulatorni moduli lokalizirani su u regijama DNK koje su udaljene od mjesta početka transkripcije. To uključuje pojačivače, prigušivače, izolatore i elemente za vezivanje. Među ovom konstelacijom elemenata, pojačivači i njihovi povezani transkripcijski faktori imaju vodeću ulogu u regulaciji ekspresije gena. Pojačivač lokalizovan u regiji DNK udaljenoj od promotorskog gena može imati vrlo veliki uticaj na ekspresiju gena, pri čemu neki geni podliježu povećanoj ekspresiji i do 100 puta zbog aktiviranog pojačivača.
Pojačivači su regije genoma koje su glavni elementi regulacije gena. Pojačivači kontroliraju programe ekspresije gena specifične za tip ćelije, najčešće tako što se kreću kroz velike udaljenosti kako bi došli u fizičku blizinu s promotorima svojih ciljnih gena. Iako postoje stotine hiljada pojačivačkih DNK regija, za određenu vrstu tkiva samo specifični pojačivači se dovode u blizinu promotora koje regulišu. U studiji neurona moždane kore pronađeno je 24.937 petlji koje dovode pojačivače do njihovih ciljnih promotora. Višestruki pojačivači, svaki često na desetinama ili stotinama hiljada nukleotida udaljenih od svojih ciljnih gena, povezuju se sa promotorima svojih ciljnih gena i mogu se međusobno koordinirati kako bi kontrolisali ekspresiju svog zajedničkog ciljnog gena.
Shematska ilustracija u ovom odjeljku prikazuje pojačivač koji se petljama kreće kako bi došao u blisku fizičku blizinu promotora ciljnog gena. Petlja je stabilizirana dimerom spojnog proteina (npr. dimerom CTCF ili YY1), pri čemu je jedan član dimera usidren za svoj vezivni motiv na pojačivaču, a drugi član usidren je za svoj vezivni motiv na promotoru (predstavljeno crvenim cik-cak linijama na ilustraciji). Nekoliko transkripcijskih faktora specifičnih za ćelijsku funkciju (u ljudskoj ćeliji postoji oko 1.600 transkripcijskih faktora ) uglavnom se vežu za specifične motive na pojačivaču i mala kombinacija ovih transkripcijskih faktora vezanih za pojačivač, kada se DNK petljom dovedu blizu promotora, upravljaju nivoom transkripcije ciljnog gena. Medijator (kompleks koji se obično sastoji od oko 26 proteina u interagirajućoj strukturi) prenosi regulatorne signale od transkripcijskih faktora vezanih za pojačivač DNK direktno do enzima RNK-polimeraza II (pol II) vezanog za promotor.
Pojačivači, kada su aktivni, uglavnom se transkribiraju s oba lanca DNK s RNK polimerazama koje djeluju u dva različita smjera, proizvodeći dvije pojačivačke RNK (eRNK) kao što je prikazano na slici. Kao i iRNK, ove eRNK su obično zaštićene svojim 5′ kap. Neaktivni pojačivač može biti vezan za neaktivni transkripcijski faktor. Fosforilacija transkripcijskog faktora može ga aktivirati, a taj aktivirani transkripcijski faktor zatim može aktivirati pojačivač za koji je vezan (pogledajte malu crvenu zvjezdicu koja predstavlja fosforilaciju transkripcijskog faktora vezanog za pojačivač na ilustraciji). Aktivirani pojačivač započinje transkripciju svoje RNK prije aktiviranja transkripcije informacijske RNK iz svog ciljnog gena.
Hipoteze Postoje dvije različite hipoteze o obradi informacija koja se odvija na pojačivačima: Enhanseosomi – oslanjaju se na visoko kooperativno, koordinirano djelovanje i mogu biti onemogućeni pojedinačnim tačkastim mutacijama koje pomjeraju ili uklanjaju mjesta vezivanja pojedinačnih proteina. Fleksibilni bilbordi – manje integrativni, više proteina nezavisno reguliše ekspresiju gena, a njihov zbir očitava bazalni transkripcioni mehanizam.
Metode proučavanja Postoje brojne metode za proučavanje pojačivača, kao što su mutageneza usmjerena na mjesto, komparativna genomika ili in vitro analiza testova vezivanja transkripcijskih faktora (npr. EMSA). Nedavno su uspostavljene metode visokog protoka koje omogućavaju naučnicima da paralelno analiziraju hiljade pojačivača. Naprimjer, masovno paralelni reporterski testovi (MPRA) i samotranskribirajuće sekvenciranje aktivnih regulatornih regija (STARR-seq) revolucionirali su karakterizaciju pojačivača. Međutim, MPRA i STARR-seq skupovi podataka generirani u ćelijskim linijama kao što su K562 pronašli su značajne nedosljednosti u pozivima pojačivača iz različitih laboratorija koje su prvenstveno posljedica tehničkih varijacija u eksperimentalnim detaljima i obradi podataka.
Primjeri u ljudskom genomu
HACNS1 HACNS1 (također poznat kao CENTG2 i smješten u Ljudskoj ubrzanoj regiji 2) je pojačivač gena "koji je možda doprinio evoluciji jedinstveno suprotstavljenog ljudskog palca, a moguće i modifikacijama u skočnom zglobu ili stopalu koje omogućavaju ljudima da hodaju na dvije noge". Dosadašnji dokazi pokazuju da je od 110.000 sekvenci pojačivača gena identifikovanih u ljudskom genomu, HACNS1 pretrpio najveće promjene tokom evolucije ljudi nakon razdvajanja s precima čimpanzi.
GADD45G Opisan je pojačivač u blizini gena GADD45g koji može regulisati rast mozga kod čimpanzi i drugih sisara, ali ne i kod ljudi. Regulator GADD45G kod miševa i čimpanza aktivan je u regijama mozga gdje se nalaze ćelije koje formiraju korteks, ventralni prednji mozak i talamus i može suzbiti daljnju neurogenezu. Gubitak pojačivača GADD45G kod ljudi može doprinijeti povećanju određenih neuronskih populacija i širenju prednjeg mozga kod ljudi.
U razvojnoj biologiji
Razvoj, diferencijacija i rast ćelija i tkiva zahtijevaju precizno regulirane obrasce ekspresija gena. Pojačivači djeluju kao cis-regulatorni elementi kako bi posredovali i prostornu i vremensku kontrolu razvoja uključivanjem transkripcije u specifičnim ćelijama i/ili njenim potiskivanjem u drugim ćelijama. Dakle, određena kombinacija transkripcijskih faktora i drugih proteina koji vežu DNK u tkivu u razvoju kontrolira koji će se geni eksprimirati u tom tkivu. Pojačivači omogućavaju da se isti gen koristi u različitim procesima u prostoru i vremenu.
Identifikacija i karakterizacija
Tradicionalno, pojačivači su identificirani tehnikama enhancer trap korištenjem reporterskog gena ili komparativnom analizom sekvenci i računarskom genomikom. U genetički prihvatljivim modelima kao što je vinska mušica Drosophila melanogaster, naprimjer, reporterski konstrukt kao što je lacZ gen može se nasumično integrirati u genom korištenjem P-elementa transpozona. Ako se reporterski gen integrira blizu pojačivača, njegova ekspresija će odražavati obrazac ekspresije koji pokreće taj pojačivač. Dakle, bojenje mušica na ekspresiju ili aktivnost LacZ i kloniranje sekvence koja okružuje mjesto integracije omogućava identifikaciju sekvence pojačivača.