miniatura|Visualització esquemàti de les rutes endocítiques adoptadoes per diferents proteïnesd'ancoratge GPI i d'altres marcadors endocítics El glicosilfosfatidilinositol (ancoratge GPI) és un glicolípid que es pot ajuntar amb l'extrem C-terminal d'una proteïna durant una modificació post-traduccional. Està formada per un grup fosfatidilinositol unit a un carbohidrat (enllaç format per una glucosamina i una manosa glicosilada al residu inositol) el qual està unit a l'extrem C-terminal d'un aminoàcid d'una proteïna madura. Els dos àcids grassos sense el grup hidròfob fosfatidilinositol ancora la proteïna a la membrana cel·lular.
Les proteïnes que s'uneixen als GPI contenen un pèptid senyal, que les condueix al reticle endoplasmàtic (RE). L'extrem C-terminal està compost d'aminoàcids hidròfobs que romanen inserits a la membrana del reticle endoplasmàtic. L'extrem hidrofòbic és llavors escindit i substituït per l'ancoratge GPI. A mesura que la proteïna avança per la via secretora, és transmesa a través de vesícules a l'aparell de Golgi, i finalment a l'espai extracel·lular on roman unida a la monocapa extracel·lular. Aquest procés d'unió és l'únic que permet la unió d'aquestes proteïnes a la membrana, i l'escissió del grup de fosfolipases es traduirà en l'alliberació controlada de la proteïna de la membrana. Aquest darrer mecanisme és utilitzat in vitro, és a dir, les proteïnes de membrana són alliberades de les membranes en l'assaig enzimàtic.
La fosfolipasa C (PLC) és un enzim que és conegut per trencar l'enllaç fosfoglicerol trobat a l'ancoratge GPI-proteïnes. El tractament amb PLC causarà l'alliberament de la unió GPI-proteïnes des de l'exterior de la membrana cel·lular. El marcador de cèl·lules T Thy-1, la acetilcolinesterasa, així com l'alcalina fosfatasa de l'intestí i de la placenta se sap que formen part d'unions GPI i són alliberades per tractament amb PLC.
Es creu que les unions GPI-proteïnes estan preferentment localitzades als lípids raft, suggerint un alt nivell d'organització dins els microdominis de la membrana plasmàtica.
Els defectes dels ancoratges de GPI produeixen la malaltia Hemoglobinúria paroxística nocturna. En aquesta malaltia el DAF (decay accelerating factor) i el CD59, probablement no estan ancorats als glòbuls rojos a causa d'una unió GPI defectuosa. Sense aquestes proteïnes vinculades a la superfície de la cèl·lula, el sistema del complement provoca la lisi de la cèl·lula i un gran nombre de RBC's són destruïts i condueixen a l'hemoglobinúria. Altres cèl·lules no es veuen afectades perquè tenen formes transmembrana de DAF i CD59.
Antecedents i descobriment Els ancoratges de proteïna fosfatidilinositol es van postular per primera vegada durant la dècada de 1970 basant-se en la capacitat de certs enzims bacterians específiques, tals com la fosfatasa-alcalina i la 5'-nucleotidasa, per alliberar proteïnes a partir de la membrana plasmàtica de les cèl·lules dels mamífers.
Cap a 1985, els primers indicis de l'existència d'aquest tipus d'ancoratges van ser revelats en diferents estudis en què es va investigar sobre la composició i l'estructura de molècules com l'acetilcolinesterasa del peix Torpede californica, l'acetilcolinesterasa d'eritròcits humans i bovins, el Thy-1 en rates, i la proteïna VSG (Variant Surface Glycoprotein) del Trypanosoma brucei, paràsit responsable de la malaltia de la son.
Finalment, el 1988, es van obtenir les primeres estructures GPI completes, concretament la de la proteïna VSG del Trypanosoma brucei i la de Thy-1 de rata.
Estructura i diversitat Diversitat de proteïnes amb ancoratges GPI miniatura|Taula 1. Exemples de proteïnes ancorades mitjançant GPI Fins a la data, s'han identificat centenars de proteïnes amb ancoratge GPI en molts eucariotes, que van des dels protozous i fongs fins als éssers humans (Taula 1). La gamma de proteïnes ancorades mitjançant GPI suggereix que aquest tipus d'ancoratge és bastant freqüent entre els eucariotes i particularment abundant en protozous les proteïnes amb ancoratge GPI són, funcionalment, molt diverses i inclouen enzims hidrolítics, molècules d'adhesió, proteïnes del sistema del complement, etc.
Estructura dels ancoratges GPI Pràcticament totes les proteïnes lligades amb ancoratge GPI comparteixen una estructura bàsica i comuna a totes elles que es conserva a la totalitat de les espècies que han estat investigades fins al moment (Taula 2).
Les estructures d'aquests ancoratges són úniques entre les associacions proteïna - carbohidrat en què l'extrem reductor de l'oligosacàrid de la GPI no està unit a la proteïna. En canvi, el residu terminal reductor de glucosamina està enllaçat mitjançant un enllaç α1 - 6 glicosídic al grup fosfatidilinositol (PI). Un residu de manosa no reductor i que es troba a certa distància s'uneix a la proteïna a través d'un pont fosfat d'etanolamina (EtNP) entre el grup hidroxil del carboni 6 de la manosa i el grup carboxil de l'aminoàcid carboxi - terminal. Les glicosilfosfatidilinositol (GPI) són un dels casos poc freqüents a la natura on la glucosamina es troba tant sense un grup acetil (com en la majoria dels glicoconjugats) o amb un sulfat (com en els proteoglicans) modificant el grup amino del carboni 2. La subestructura Manα1 - 4GlcNα1 - 6mioinositol - 1- P - lípid és una característica universal dels ancoratges GPI i de les seves estructures relacionades. En el llevat Saccharomyces cerevisiae, les restes de diacilglicerol dels ancoratges GPI se substitueixen extensament amb ceramides després de la fixació de l'ancoratge GPI a la proteïna.
Les estructures dels ancoratges GPI són molt diverses, depenent de la proteïna a la qual estan units i de l'organisme en què se sintetitzen. Amb una excepció coneguda, els nuclis de les proteïnes lligades mitjançant ancoratges GPI contenen un mínim de tres residus de manosil en la seqüència de EtNP - 6Manαl - 2Manα1 - 6Manα1 - 4GlcNα1 -6 (PI), on EtNP es refereix al pont fosfat d'etanolamina, ' Man' a manosa, i ' GlcN ' a glucosamina Hi ha una considerable variació en la meitat PI. De fet, GPI és un terme bastant fluix, ja que, en concret, PI es refereix a D - mioinositol - 1- P -3 (sn -1,2 - diacilglicerol), mentre que molts GPI contenen altres tipus de fosfolípids d'inositol, com ara la inositol fosfoceramida. De la mateixa manera, també hi ha altres variacions, com la caracteritzada per la presència d'un àcid gras unit mitjançant un enllaç [ [ èster ] ] a l'hidroxil del carboni 2 del residu d'inositol. La presència d'aquesta modificació fa l'ancoratge resistent a l'acció del PLC bacterià específic per a PI. Les dades estructurals disponibles de lípids suggereixen que els enllaços de proteïnes amb GPI mitjançant inositol fosfoceramida només es troben en els eucariotes més senzills, com ara Saccharomyces cerevisiae , Aspergillus niger , Dictyostelium discoideum , i T. cruzi . Per exemple, en el llevat Saccharomyces cerevisiae , les restes de diacilglicerol dels ancoratges GPI són àmpliament substituïts amb ceramides després de la fixació de l'ancoratge de GPI a la proteïna.
Els factors que controlen la síntesi d'un ancoratge de glicosilfosfatidilinositol madur trobat en una proteïna donada semblen ser similars als d'altres modificacions posteriors a la traducció com ara la N-glicosilació i la O-glicosilació. Per tant, el control primari és a escala cel·lular, de manera que seran els enzims específics biosintètics els que decidiran el ventall definitiu de les estructures. El control secundari és a nivell de l'estructura terciària / quaternària de la proteïna que porta l'ancoratge GPI, i això afecta l'accessibilitat dels enzims de processament. Un exemple de control primari es troba en les diferències en les cadenes laterals de glicans a les GPI a l'enzim membrana dipeptidasa entre humans i bovins. I un exemple de control secundari és la diferència entre les cadenes laterals de glicà de VSG (Variant Surface Glicoprotein) quan alguns d'aquests enzims amb diferents seqüències carboxi - terminals s'expressen en el mateix Trypanosoma.
Estructures GPI no lligades En cèl·lules de mamífers, algunes GPI lliures es troben a la superfície cel·lular, però la seva importància funcional és desconeguda. D'altra banda, diversos protozous, sobretot tripanosomàtids, expressen números alts (més de 10 ^ 7 còpies per cèl·lula) de GPI lliures en la seva superfície cel·lular com a productes metabòlics finals. Aquests inclouen els fosfolípids de glicoinositol (GIPLs) i lipofosfoglicans (GLP) de la Leishmania.
La química dels ancoratges GPI Els ancoratges glicosilfosfatidilinositol són molècules complexes que inclouen enllaços amida, glicosídics, fosfodièster i els vincles hidroxièster entre els seus diversos components. El repte de la seva síntesi orgànica total va reunir grups de diversos països, incloent-hi Japó, Estats Units, Alemanya i el Regne Unit. L'estructura d'aquests ancoratges es pot separar de forma selectiva mitjançant diversos reactius químics i enzimàtics. Aquests es van utilitzar al principi per tal de determinar la morfologia de les GPI i ara s'apliquen per confirmar la seva presència. Una reacció clau, des d'una perspectiva analítica, és la desaminació (és a dir, la ruptura d'un grup amino) per àcid nitrós del residu de glucosamina. A través d'aquesta reacció obtenim una escissió molt específica de l'enllaç glucosídic entre la glucosamina i l'inositol. La reacció allibera el PI (fosfatidilinositol), que es pot aïllar i ser analitzat per espectrometria de masses, i genera un extrem reductor lliure al glicà de GPI en forma de anhidromanosa (aMan). Una vegada que aquest residu es marca radioactivament o fluorescentment i es desfosforila, el glicà pot ser convenientment seqüenciat utilitzant exoglicosidases (enzims que tallen els enllaços glucosídics dels sucres terminals).
El fet d'obtenir la disposició completa dels ancoratges GPI és un procés ardu que requereix relativament grans quantitats de material de partida. En aquest treball s'avalua el grau d'informació estructural que es pot obtenir a partir d'una glicoproteïna ancorada a GPI prèviament ben caracteritzada, que generalment és la VSG de "Trypanosoma brucei".
Biosíntesi La biosíntesi de l'ancoratge GPI es dona en gran part en el reticle endoplasmàtic (tant en la seva membrana com en el lumen) i en menor part a l'aparell de Golgi.
Aquesta biosíntesi és iniciada a la cara citoplasmàtica de la membrana del reticle endoplasmàtic amb la transferència de la N-acetilglucosamina de UDP-GlcNac a un fosfoinositol (una de les parts principals de la molècula de GPI) gràcies a una glucosiltransferasa. D'aquesta transferència es forma GlcNac-P. Seguidament el GlcNac-P pateix una N-deacetilació i es forma GlcN-PI.
Arribat aquest punt la molècula segueix la seva síntesi al lumen del reticle endoplasmàtic on es dona una acilació del grup inositol, alguns estudis han suggerit que el donant d'aquest grup acil és l'acil coenzim A. A part, i de nou a la cara citoplasmàtica de la membrana del reticle endoplasmàtic, se sintetitza dolicol-fosfat-manosa que donarà les manoses a la molècula de GPI.
Seguidament les dues primeres manoses són transferides a la molècula des del dolicol-fosfat-manosa i s'afegeix una fosfatetanolamina a la primera manosa. Seguidament s'afegeix una tercera manosa i en segons quines espècies una quarta i s'acaba afegint una fosfatetanolamina a la segona i tercera manoses.
Un cop el GPI està sintetitzat, aquest s'uneix a una proteïna prèviament sintetitzada pel seu extrem C-terminal. Aquesta proteïna a la qual s'uneix el GPI ha de tenir tres característiques bàsiques:
Posseir un senyal peptídic que la faci entrar al lumen del reticle endoplasmàtic Posseir un senyal peptídic a l'extrem C-terminal que la uneixi amb la membrana del reticle endoplasmàtic mentre el GPI s'uneix Posseir un triplet d'aminoàcids que permeti la unió del GPI