PCR en temps real

La PCR quantitativa, qPCR, Q-PCR(de l'anglès quantitative polymerase chain reaction) o PCR en temps real(de l'anglès real time PCR) és una variant de la reacció en cadena de la polimerasa (PCR) que es fa servir per amplificar i quantificar en termes absoluts el producte de l'amplificació, l'àcid desoxiribonucleic (ADN). Igual que en la PCR convencional, s'empra un motlle d'ADN, almenys un parell d'encebadors específics, dNTP, un amortidor de reacció adequat i una polimerasa d'ADN termoestable. S'afegeix a aquesta barreja una substància marcada amb un fluoròfor que, en un termociclador dotat de sensors per mesurar fluorescència, després de ser excitat a la longitud d'ona apropiada, permeti mesurar la taxa de generació d'un o més productes específics. Aquest mesurament es fa després de cada cicle d'amplificació, motiu pel qual també se la denomina PCR en temps real. En molts casos el motlle emprat per la PCR quantitativa no és ADN des del principi, sinó que pot ser ADN complementari (ADNc) monocatenari, obtingut per retrotranscripció de l'àcid ribonucleic (ARN); en aquest cas, s'utilitzen les denominacions RT-PCR quantitativa, RT-PCR en temps real o RT-Q-PCR. No s'ha de confondre amb la tècnica de la PCR amb transcripció inversa(RT-PCR, de l'anglès reverse transcriptase PCR), en què hi ha un pas de retrotranscripció d'ARN a ADN que no quantifica necessàriament el producte en temps real.

Juntament amb els xips d'ADN, la PCR quantitativa és la metodologia més moderna per estudiar l'expressió gènica, tot i que altres mètodes tradicionals com el Northern blot també permeten observar-la amb una menor precisió.Michael W. Pfaff, Ales Tichopad, Christian Prgomet i Tanja P. Neuvians (2005). Determination of stable housekeeping genes, differentially regulated target genes and sample integrity: BestKeeper – Excel-based tool using pair-wise correlations Biotechonology Letters 26:509-515 La variabilitat introduïda a la quantificació, que comporta un marge d'error en l'estimació, deriva de la integritat de l'ADN, l'eficiència enzimàtica i molts altres factors, per la qual cosa s'han desenvolupat nombrosos sistemes d'estandardització. N'hi ha que quantifiquen de manera absoluta l'expressió gènica, però és més habitual que estiguin enfocats a la quantificació relativa del gen d'estudi respecte a un altre, denominat "normalitzador", que és seleccionat per la seva expressió gairebé constant. Aquests gens solen rebre el nom de "gens de manteniment" perquè sovint estant implicats en funcions bàsiques per a la supervivència cel·lular, cosa que sol comportar una expressió constitutiva.Pfaffl MW, Horgan GW, Dempfle L (2002). Relative expression software tool (REST©) for group-wise comparison and statistical analysis of relative expression results in real-time PCR. Nucl. Acids Res. 30: e36. Mesurant els gens d'interès a cada experiment i dividint el resultat per l'expressió del gen normalitzador seleccionat és possible comparar els gens objectiu, fins i tot sense conèixer-ne el nivell d'expressió en termes absoluts. Els gens normalitzadors més emprats són els que codifiquen proteïnes com la tubulina, la gliceraldehid-3-fosfat deshidrogenasa, l'albúmina, la ciclofilina o ARN ribosòmics.

Fonaments

La PCR quantitativa es duu a terme en un termociclador capaç de fer incidir sobre cada mostra un feix de llum d'una longitud d'ona determinada, així com de detectar la fluorescència emesa pel fluorocrom excitat. Aquest termociclador pot escalfar i refredar ràpidament les mostres, aprofitant les qualitats fisicoquímiques dels àcids nucleics i les qualitats enzimàtiques de l'ADN polimerasa.

El procés de la PCR consisteix en una sèrie de canvis de temperatura que repetits entre 25 i 40 vegades, anomenats cicles, cadascun amb un mínim de tres etapes: la primera, al voltant de 95 °C, permet la separació dels àcids nucleics de la doble cadena; la segona, a una temperatura al voltant de 50-60 °C, permet l'alineament dels encebadors a l'ADN motlle; i la tercera, a 68-72 °C, facilita la polimerització per part de l'ADN polimerasa. A causa de la petitesa dels fragments amplificats generalment en aquest tipus de PCR, es pot ometre l'últim pas, car l'enzim és capaç d'amplificar durant la rampa entre la temperatura d'alineament i la de desnaturalització. A més, alguns termocicladors afegeixen a cada cicle uns segons a una altra temperatura, com ara 80 °C, per tal de reduir el soroll generat per la presència de dímers d'encebadors quan s'empra un colorant inespecífic. Les temperatures utilitzades i el temps aplicat a cada cicle depenen d'una gran varietat de paràmetres, com l'enzim utilitzat per la síntesi d'ADN, la concentració d'ions divalents i desoxiribonucleòtids (dNTP) en la reacció i la temperatura d'unió dels encebadors.

Classificació Les tècniques de PCR quantitativa es poden classificar segons l'ús o bé de fluorocroms no específics o bé de sondes moleculars dependents de la seqüència.

En les tècniques basades en fluorocroms inespecífics es detecta la generació exponencial d'ADN bicatenari emprant un fluorocrom que s'hi uneix inespecíficament. Un exemple de colorant que permet aquesta detecció és el SYBR Green, que quan és excitat amb llum blava (λmax = 488 nm) emet llum verda (λmax = 522 nm). Presenta l'avantatge de requerir només un parell d'encebadors per dur a terme l'amplificació, cosa que abarateix el seu cost, però només és possible amplificar un producte a cada reacció. Les tècniques basades en sondes específiques utilitzen com a mínim un oligonucleòtid marcat amb fluorescència. Aquesta sonda està unida típicament a dos fluorocroms i hibrida a la zona intermèdia entre l'encebador directe (forward) i l'invers (reverse), és a dir, a l'amplicó. Així doncs, quan la sonda està intacta, presenten una transferència energètica de fluorescència per ressonància (FRET). Aquesta FRET no es produeix quan els dos fluorocroms estan distants a causa de la degradació de la sonda mitjançant l'activitat 5'- 3' exonucleasa de l'ADN polimerasa, o la separació física dels fluorocroms per un canvi en la conformació de la sonda. Això permet seguir el canvi del patró de fluorescència i deduir el nivell d'amplificació del gen.

Anàlisi de la temperatura de fusió miniatura|Diferents corbes de fusió de diversos productes de PCR (en colors diferents). S'observen reaccions amb amplificació d'un producte específic (rosa i blau) i altres amb resultat negatiu (verd i taronja). S'assenyala amb una fletxa el pic de fusió donat pels dímers d'encebadors, diferent a l'esperat pel producte d'amplificació en qüestió. Mitjançant l'ús un fluorocrom d'unió inespecífic a la doble cadena d'ADN, generalment SYBR Green, la Q-PCR permet identificar fragments amplificats d'ADN concrets a partir de la temperatura de fusió (també anomenat valor t, de l'anglès melting temperature), que és específica pel fragment amplificat que s'està buscant, i els resultats són obtinguts a partir de l'observació de la corba de dissociació de les mostres d'ADN analitzades.

A diferència de la PCR convencional, això permet evitar l'ús posterior de tècniques d'electroforesi per visualitzar els resultats de totes les mostres. Malgrat que la PCR quantitativa és una tècnica cinètica, sol ser avaluada a punt final. Així, aquesta tècnica porta a l'obtenció de resultats més ràpids, i/o una menor despesa de reactius emprats en les tècniques d'electroforesi, si segons el criteri de l'investigador, posteriorment cal córrer en gels només les mostres, els resultats previs al PCR en temps real es poden considerar dubtosos i/o per ratificar resultats en mostres positives.

Quantificació de l'expressió gènica La quantificació es pot realitzar en termes absoluts o relatius. En el primer cas, l'estratègia és relacionar el senyal d'amplificació obtingut amb el contingut en ADN emprant una corba de calibratge; és vital que les PCR de la mostra i dels elements de la recta de calibratge tinguin la mateixa eficiència d'amplificació. En el segon cas, s'expressa el canvi en els nivells d'expressió d'ARN missatger (ARNm) interpretat com a ADN complementari (ADNc, generat per retrotranscripció de l'ARNm); aquesta quantificació relativa és més fàcil de realitzar, car no requereix la corba de calibratge, i es basa en la comparació entre el nivell d'expressió del gen estudiat versus un gen de control (també anomenat de referència, intern o normalitzador i, en anglès, housekeeping gene).

Per tant, en la quantificació relativa és irrellevant en quines unitats s'expressa la quantificació i els seus resultats són comparables entre múltiples experiments de RT-Q-PCR. De fet, el propòsit d'utilitzar un o més gens de normalització és corregir la variació no específica, com diferències en la quantitat i qualitat de l'ARN emprat, que poden afectar les eficiències de retrotranscripció i de PCR. No obstant això, l'aspecte crucial és que l'estabilitat del gen de referència sigui una realitat.

La selecció dels gens interns s'ha realitzat clàssicament en biologia molecular analitzant l'estabilitat de l'expressió en estudis qualitatius o de baixa sensibilitat, com l'examen visual de gels d'ARN, densitometria de Northern blots o PCR semiquantitativa (PCR Mimic). En plena era de la genòmica, és possible realitzar una aproximació a gran escala utilitzant els xips d'ADN en el cas de molts organismes. Tanmateix, s'ha observat que la majoria dels gens empleats com normalitzadors en la quantificació de l'expressió d'ARN missatger varien segons les condicions experimentals.Dheda K, Huggett JF, Bustin SA, Johnson MA, Rook G, Zumla A (2004). Validation of housekeeping genes for normalizing RNA expression in real-time PCR. Biotechniques 37 (1), pp: 112-119. Per això, cal fer un estudi metodològic previ emprant eines estadístiques per tal de seleccionar els gens més apropiats.

S'han desenvolupat diversos algorismes estadístics que detecten quin o quins gens són els més apropiats per normalitzar un conjunt de teixits sota unes condicions donades. Alguns, com geNORM o BestKeeper, realitzen sobre una matriu d'expressió de gens de referència per diversos teixits, comparacions per parells i mitjanes geomètriques.Pfaffl MW, Tichopad A, Prgomet C, Neuvians TP (2004). Determination of stable housekeeping genes, differentially regulated target genes and sample integrity: BestKeeper—Excel-based tool using pair-wise correlations. Biotechnol Lett 26 (6), pp: 509-515.

Modelització A diferència de la PCR de punt final (PCR convencional), la PCR en temps real permet quantificar el nivell de producte obtingut a qualsevol moment de l'amplificació mitjançant el senyal de fluorescència o, més concretament, mitjançant el seu nivell sobre un llindar. Els valors de fluorescència són expressats en forma de logaritmes per tal d'estudiar fàcilment la fase exponencial d'amplificació, que apareix com una línia recta en representar gràficament el logaritme de la fluorescència davant del nombre de cicle. Aquest segment, denominat segment quantificable, permet valorar la quantitat d'ADN inicial.

800px|center|Modelització

Gràfic de l'esquerra (A) Les cinètiques de tres PCR de tres mostres diferents (K, L i M) de concentracions d'ADN inicial decreixents (concretament, cada vegada es redueixen a 1/10) es representen en una gràfica logarítmica de la fluorescència (en ordenades) davant del cicle de PCR (en abscisses). No es representen les fases prèvies a l'exponencial.

Zona de segments quantificables de cada mostra. La zona de saturació, fora ja de la zona lineal, es mostra en gris. Cadascun dels segments quantificables permet definir una equació de la recta de tipus U = ax b, que permet modelitzar l'eficiència de l'amplificació (el pendent a) i, mitjançant l'ordenada a l'origen b, la quantitat d'ADN al cicle 0, almenys teòricament.