miniatura|Western blot mitjançant un anticòs que reconeix proteïnes modificades amb àcid lipoic El western blot (de vegades anomenat proteïna immunoblot), o western blot, és una tècnica analítica àmpliament utilitzada en biologia molecular i immunogenètica per a detectar proteïnes específiques en una mostra d'homogeneïtzació o extracte de teixits.
En resum, la mostra experimenta una desnaturalització de proteïnes, seguida d'una electroforesi en gel. A sintètic o d'origen animal anticòs (conegut com el anticòs primari) es cregui que reconeix i s'uneix a una proteïna diana específica. La membrana d'electroforesi es renta en una solució que conté l'anticòs primari, abans que es renti l'excés d'anticòs. S'afegeix un anticòs secundari que reconeix i s'uneix a l'anticòs primari. L'anticòs secundari es visualitza mitjançant diversos mètodes com la tinció, la immunofluorescència i la radioactivitat, cosa que permet la detecció indirecta de la proteïna diana específica.
Altres tècniques relacionades inclouen l'anàlisi de transferència de punts, la transferència quantitativa de punts, la immunohistoquímica i la immunocitoquímica, on s'utilitzen anticossos per detectar proteïnes en teixits i cèl·lules mitjançant immunotinció i assaig d'immunosorbents lligats a enzims (ELISA).
El nom de western blot és un joc de paraules amb Southern blot, una tècnica per a la detecció d'ADN que porta el nom del seu inventor, el biòleg anglès Edwin Southern. De la mateixa manera, la detecció d'ARN es denomina Northern Blot. W. Neal Burnette va donar el terme "western blot" el 1981, encara que el propi mètode es va originar el 1979 al laboratori de Harry Towbin a l'Institut Friedrich Miescher de Basilea, Suïssa. Entre el 1979 i el 2019 "s'ha esmentat als títols, resums i paraules clau de més de 400.000 publicacions llistades a PubMed " i pot continuar sent la tècnica d'anàlisi de proteïnes més utilitzada.
Aplicacions El western blot s'utilitza àmpliament en bioquímica per a la detecció qualitativa de proteïnes individuals i modificacions de proteïnes (com ara modificacions post-translacionals). S'estima que almenys el 8-9% de totes les publicacions relacionades amb les proteïnes apliquen western blots. S'utilitza com a mètode general per identificar la presència d'una única proteïna específica dins d'una barreja complexa de proteïnes. Es pot obtenir una estimació semi-quantitativa d'una proteïna a partir de la mida i la intensitat del color d'una banda de proteïnes a la membrana de la transferència. A més, l'aplicació d'una sèrie de dilució d'una proteïna purificada de concentracions conegudes es pot utilitzar per permetre una estimació més precisa de la concentració de proteïnes. El western blot s'utilitza habitualment per verificar la producció de proteïnes després de la clonació. També s'utilitza en diagnòstics mèdics, per exemple, a la prova del VIH o a la prova d' ESB.
La prova de confirmació del VIH utilitza un western blot per detectar anticossos anti-VIH en una mostra de sèrum humà. Les proteïnes de cèl·lules conegudes infectades pel VIH estan separades i esborrades en una membrana com es va esmentar anteriorment. A continuació, el sèrum a provar s'aplica a la fase d'incubació d'anticossos primaris; s'anticipa l'anticòs lliure i s'afegeix un anticòs antihumà secundari lligat a un senyal enzimàtic. Les bandes tenyides indiquen llavors les proteïnes a les quals el sèrum del pacient conté anticossos.
També s'utilitza un western blot com a prova definitiva per a la variant de la malaltia de Creutzfeldt-Jakob, un tipus de malaltia prionial relacionada amb el consum de vedella contaminada del bestiar amb encefalopatia espongiforme bovina (EEB, coneguda habitualment com a "malaltia de les vaques boges").
Una altra aplicació es troba en el diagnòstic de tularèmia. Una avaluació de la capacitat de Western blot per detectar anticossos contra F. tularensis va revelar que la seva sensibilitat és gairebé del 100% i l'especificitat del 99,6%.
Algunes formes de proves de la malaltia de Lyme utilitzen Western Blot. Un western blot també es pot utilitzar com a prova de confirmació de la infecció per hepatitis B i la infecció per HSV-2 (herpes tipus 2) En medicina veterinària, de vegades s'utilitza un western blot per confirmar l'estat de FIV + en gats.
Altres aplicacions de la tècnica western blot inclouen el seu ús per l'Agència Mundial Antidopatge (WADA). El dopatge sanguini és l'ús indegut de certes tècniques i / o substàncies per augmentar la massa de glòbuls vermells, cosa que permet al cos transportar més oxigen als músculs i, per tant, augmentar la resistència i el rendiment. Hi ha tres substàncies o mètodes àmpliament coneguts que s'utilitzen per al dopatge sanguini, a saber, l'eritropoietina (EPO), els portadors d'oxigen sintètics i les transfusions de sang. Cadascun està prohibit segons la llista de substàncies i mètodes prohibits de l'AMA. La tècnica western blot es va utilitzar durant la Copa Mundial de la FIFA 2014 en la campanya antidopatge d'aquest esdeveniment. En total, més de 1000 mostres van ser recollides i analitzades per Reichel, et al. al Laboratori acreditat per l'AMA de Lausana, Suïssa. Investigacions recents que utilitzen la tècnica de Western blot van mostrar una millor detecció d'EPO en sang i orina basada en nous gels horitzontals prefabricats Velum SAR optimitzats per a anàlisis rutinaris. https://precisionbiosystems.com/wp-content/uploads/2016/10/Application_Note_Improvements-for-EPO-detection_Schwenke_2015.pdf Amb l'adopció de la SAR-PAGE horitzontal en combinació amb els gels Velum SAR suportats per pel·lícula prefabricats, es va millorar significativament la capacitat discriminatòria de l'aplicació de micro-dosis de rEPO.
Procediment El mètode Western blot es compon d'una electroforesi en gel per separar proteïnes natives mitjançant una estructura 3-D o proteïnes desnaturalitzades per la longitud del polipèptid, seguida d'una transferència electroforètica a una membrana (majoritàriament PVDF o nitrocel·lulosa) i un procediment d'immunotinció per visualitzar determinada proteïna a la membrana de la transferència. SDS-PAGE s'utilitza generalment per a la desnaturalització de la separació electroforètica de proteïnes. El SDS s'utilitza generalment com a tampó (així com en el gel) per tal de donar a totes les proteïnes presents una càrrega negativa uniforme, ja que les proteïnes poden estar carregades de manera positiva, negativa o neutral. Aquest tipus d'electroforesi es coneix com a SDS-PAGE (electroforesi en gel de poliacrilamida SDS). Abans de l'electroforesi, sovint es bullen mostres de proteïnes per desnaturalitzar les proteïnes presents. Això garanteix que les proteïnes estiguin separades en funció de la mida i eviti que les proteases (enzims que descomponen les proteïnes) degradin mostres. Després de la separació electroforètica, les proteïnes es transfereixen a una membrana (típicament nitrocel·lulosa o PVDF), on es bloquegen amb llet (o altres agents de bloqueig) per evitar la unió no específica d'anticossos, i després es tenyeixen amb anticossos específics de la proteïna objectiu. Finalment, la membrana es tenyirà amb un anticòs secundari que reconeix la primera tinció d'anticossos, que després es pot utilitzar per a la detecció mitjançant diversos mètodes. El pas d'electroforesi en gel s'inclou en l'anàlisi Western blot per resoldre el problema de la reactivitat creuada dels anticossos.
Electroforesi en gel Les proteïnes de la mostra es separen mitjançant electroforesi en gel. La separació de proteïnes pot ser per punt isoelèctric (pI), pes molecular, càrrega elèctrica o una combinació d'aquests factors. La naturalesa de la separació depèn del tractament de la mostra i de la naturalesa del gel.
De llarg, el tipus més comú d'electroforesi en gel utilitza gels de poliacrilamida i tampons carregats amb dodecilsulfat de sodi (SDS). SDS-PAGE (electroforesi en gel de poliacrilamida SDS) manté els polipèptids en estat desnaturalitzat una vegada que han estat tractats amb forts agents reductors per eliminar l'estructura secundària i terciària (per exemple, enllaços disulfurs [SS] a grups sulfhidril [SH i SH]) i permet així la separació de proteïnes per la seva massa molecular. Les proteïnes de la mostra es cobreixen en la SDS carregada negativament, convertint-se efectivament en anióniques, i migren cap a l'ànode carregat positivament (de més tensió) (que normalment té un fil vermell) a través de la malla d'acrilamida del gel. Les proteïnes més petites migren més ràpidament a través d'aquesta malla i, per tant, les proteïnes se separen segons la mida (normalment mesurada en kilodaltons, kDa). La concentració d'acrilamida determina la resolució del gel: com més gran sigui la concentració d'acrilamida, millor serà la resolució de les proteïnes de menor pes molecular. Com més baixa sigui la concentració d'acrilamida, millor serà la resolució de proteïnes de major pes molecular. Les proteïnes només viatgen en una dimensió al llarg del gel per a la majoria de borrons.
Les mostres es carreguen als pous del gel. Un carril sol estar reservat per a un marcador o escala, que és una barreja disponible comercialment de proteïnes de pesos moleculars coneguts, típicament tenyides per formar bandes visibles i de colors. Quan s'aplica tensió al llarg del gel, les proteïnes migren a través d'ell a diferents velocitats en funció de la seva mida. Aquests diferents índexs d'avanç (diferents mobilitats electroforètiques) es separen en bandes dins de cada carril. Les bandes de proteïnes es poden comparar amb les bandes d'escala, cosa que permet estimar el pes molecular de la proteïna. miniatura|Electroforesi SDS-PAGE També és possible utilitzar un gel bidimensional que dissemini les proteïnes d'una sola mostra en dues dimensions. Les proteïnes es separen segons el punt isoelèctric (pH en què tenen una càrrega neta neutra) a la primera dimensió i segons el seu pes molecular a la segona dimensió.
Transferència Per fer les proteïnes accessibles a la detecció d'anticossos, es traslladen des del gel a una membrana feta de nitrocel·lulosa (NC) o difluorur de polivinilidè (PVDF). El mètode més utilitzat per transferir les proteïnes s'anomena electroblotting. L'electrotransferència utilitza un corrent elèctric per arrossegar les proteïnes carregades negativament del gel cap a l'ànode carregat positivament i cap a la membrana PVDF o NC. Les proteïnes es mouen des del gel cap a la membrana mantenint l'organització que tenien dins del gel. Un mètode de transferència més antic consisteix a col·locar una membrana a sobre del gel i a sobre una pila de papers filtrants. Tota la pila es col·loca en una solució tampó que fa pujar el paper per acció capil·lar, portant les proteïnes. A la pràctica, aquest mètode no s'utilitza habitualment a causa del llarg temps del procediment.
Com a resultat de qualsevol procés de transferència, les proteïnes s'exposen sobre una fina capa de membrana per a la seva detecció. Les dues varietats de membrana s'escullen per les seves propietats d'unió a proteïnes no específiques (és a dir, uneixen totes les proteïnes per igual). La unió de proteïnes es basa en interaccions hidròfobes, així com en interaccions carregades entre la membrana i la proteïna. Les membranes de nitrocel·lulosa són més barates que el PVDF, però són molt més fràgils i no poden suportar sondejos repetits. miniatura|Transferència Western blot