L'onconasa (ONC) és una proteïna de la família de les ribonucleases pancreàtiques, concretament la més petita coneguda fins al moment, que s'obté de la granota leopard. Es tracta d'una proteïna més bé senzilla, formada únicament per 104 residus i amb una massa molecular de 11,816 kDa. Consta d'una estructura terciària extremadament compacta, el que suggereix una alta estabilitat confromacional. De fet, presenta una gran estabilitat, ja que té una temperatura de desnaturalització inusulament alta, d'aproximadament 90 °C. Les seves propietats fan que tingui una elevada activitat citotòxica i citostàtica que permet que, actualment hi hagi nomrosos estudis que investiguen l'efectivitat d'aquesta proteïna com a potencial antitumoral per al tractament contra el càncer i com a antiviral per combatre el virus del VIH o el virus d'Ebola, entre d'altres.
Història L'onconassa pertany a la família de les RNases (ribonucleases), les quals han estat un grup d'enzims àmpliament estudiat des de 1960. Van ser un model important per a la majoria dels estudis centrats en la química de proteïnes, el seu plegament, la seva estabilitat i la catàlisi enzimàtica. Les investigacions recents sobre la família de les RNases s'ha centrat principalment a explorar les seves funcions biològiques i aplicacions mèdiques.
Als primers estudis realitzats l'any 1973, es va demostrar una activitat antitumoral a extractes d'embrions de granota leopard. Més d'una dècada més tard, el 1987, el principal component actiu d'aquests extractes es va aïllar i purificar. El resultat mostrà una proteïna bàsica, de mida petita (uns 12 Kd aproximadament) d'origen matern (present també en grans quantitats en oòcits no fecundats). La seva seqüència d'aminoàcids completa fou determinada i es trobà que era única, no coincidia amb cap altra proteïna detectada fins al moment.
Sorprenentment, resultà similar a la de la RNasa A, i altres membres de la família de les RNases. Els tres residus catalítics de la proteïna coincidien amb els llocs catalítics de l'RNasa A, així com altres residus que formen part del seu centre actiu. Així, la proteïna semblava estar totalment equipada per exercir l'activitat ribonucleolítica, i de fet es va trobar capaç de degradar ARN molt polimeritzat de llevats. Provisionalment s'anomenà la proteïna: proteïna P-30, però més endavant se li va assignar el seu nom actual: Onconasa.
Característiques moleculars L'onconasa és el membre més petit de la superfamília de les ribonucleases pancreàtiques i va ser purificada a partir d'embrions i oòcits de Rana pipiens. Està conformada per 104 aminoàcids i és una proteïna molt bàsica, ja que té un punt isoelèctric (pI) de 9,7. Té una massa molecular d'entre 11.819,6 i 11.834,7 Da tenint en compte la total protonació dels residus de lisina i arginina.
L'onconasa conserva un 28% de l'estructura primària de la RNasa A. Entre altres coses, això ho podem veure perquè l'onconasa presenta dues característiques molt típiques de les ribonucleases dels amfibis: un pont disulfur a l'extrem C-terminal i un piroglutamat N-terminal.
Estructura Estructura primària L'onconasa és un pèptid més aviat curt, amb 104 residus. No obstant, és polimòrfica en la posició 25, on normalment trobem una treonina (Thr) però en un 30% dels casos trobem una serina (Ser). Aquests aminoàcids es troben allunyats del centre actiu i, per tant, que hi hagi un aminoàcid o un altre no afecta l'activitat enzimàtica. Quant als residus terminals, s'ha vist que en concret el residu de piroglutamat és d'especial importància en l'activitat catalítica de la proteïna. Alguns estudis han demostrat que en canviar el piroglutamat natiu per una metionina N-terminal, l'activitat enzimàtica i la citotoxicitat de la molècula disminueixen significativament.
Estudis recents han demostrat que el genoma de Rana pipiens codifica fins a 4 variants diferents de l'onconasa. Les modificacions aminoacídiques més freqüents es troben en les posicions 11, 20, 25, 85 i 103. +CARACTERÍSTIQUES DE LES VARIANTS DE L'ONCONASAVariant de OncPes molecular (Da)Punt isoelèctricOnc (Thr25)118209,7Onc (Ser25)118069,7I11V, D20N, S103R-Onc118749,94 Determinades cristal·lografies van confirmar que la tríada catalítica de les ribonucleases (His12, Lys41, His119) es conserva de manera pràcticament estricta en les onconases (His10, Lys31, His97).
Tot i presentar un residu glicosil·lable (Asn69), a dia d'avui no s'ha aconseguit aïllar mostres glicosil·lades naturalment.
Residus que intervenen en la unió al substrat La funció de l'onconasa, com la de totes les ribonucleases és la de degradar àcids ribonucleics i això ho fan mitjançant la unió d'alguns dels seus aminoàcids amb seqüències específiques de l'RNA a degradar.
Mentre que alguns homòlegs de la RNasa A tendeixen a unir-se a un residu de pirimidina (citosina o uracil) pel costat 5’ de l'enllaç fosfodièster, l'onconasa té altres preferències. Aquesta tendeix a unir-se pel costat 3’ de l'enllaç fosfodièster dels nucleòsids de guanosina. Tot i haver-se postulat que el tRNA és el substrat per excel·lència de l'onconasa, actualment es creu que també pot actuar sobre altres tipus de micro-RNA (miARN).miniatura|Seqüència d'aminoàcids de l'onconasa.|422x422px
Quan l'onconasa s'uneix al fragment de RNA, generalment ho fa en la seqüències A-U-G-A. ELs llocs d'unió són 2 i es coneixen com a B1 i B₂. Diversos residus aminoacídics queden en contacte estret amb els segments entre nucleòtids. De fet, és tan estret que la distància entre Lys33 i l'uracil de la seqüència és de només 3,73Å. L'esmentada Lys33 juntament amb Thr35, Asp67 i la Phe98 queden molt a prop de l'uracil i la Thr35 forma ponts d'hidrogen amb el nitrogen i l'oxigen d'aquest nucleòtid. Aquest conjunt forma lloc d'unió B1.
Paral·lelament, en el lloc d'unió B₂, la Glu91 forma dos ponts d'hidrogen amb la nucleobase de guanina de la seqüència AUGA. En B₂ també hi trobem la Thr89.
Estructura secundària miniatura|Diagrama de cintes Uns estudis van trobar que l'estructura secundària de l'onconasa és molt similar a la de l'RNasa A (ribonucleasa pancreàtica bovina), la seva homòloga. Concretament es va comprovar que dos de cada tres hèlixs i la part principal de les cadenes antiparal·leles, tenien una longitud i posició força semblants. Tanmateix, la principal diferència es troba en la posició i conformació dels bucles o girs. L'onconasa està conformada per dues làmines beta de 3 cadenes antiparal·leles cadascuna (40,4%), tres hèlixs alfa (20,2%) i diversos girs que les connecten (9,4%). Podem aprofundir una mica més en aquesta estructura: +ESTRUCTURA SECUNDÀRIAResidusEstructuraAminoàcids3 - 10Hèlix α1WLTFQKKH11 - 13Gir irregularITN19 - 23Hèlix α2CDNIM28 - 31Gir tipus IFHCK33-38β1 del full 1KNTFIY41 - 48Hèlix α3PEPVKAIC49 - 51Gir tipus IIKGI55 - 58β2 del full 2KNVL63 - 70β3 del full 1FYLSDCNV73 - 76Gir de tipus IIRPCK77 - 84β4 del full 1YKLKKSTN86 - 91β5 del full 2FCVTCE92 - 93Gir de tipus INQ94 - 101β6 del full 2APVHFVGV miniatura|Esquema estructura secundària A l'extrem N-terminal i trobem dos residus, Pyr1 i Asp2, i en el C-terminal tres, Gly, Ser i Cys. El Pyr1 o piroglutàmic es forma per la ciclació sobre el grup N-terminal de la cadena lateral de la glutamina i té una formiletionina a la posició 1, això serà de gran importància per l'estructura terciària. També hi trobem quatre ponts de disulfur entre les cisteïnes que mantenen l'estructura estable, tres d'ells són visibles: Cys30-Cys75, Cys48-Cys90 i Cys87-Cys104. El quart està amagat darrera de la cadena β3 i involucra: Cys19-Cys68
Estructura terciària L'onconasa té una estructura terciària molt compacta a causa de la particularitat del seu extrem N-terminal, el qual està estabilitzat per Pyr1 i del pont de disulfur que involucra la cisteïna 104 de l'extrem C-terminal. El piroglutàmic és trascendental per l'activitat que duu a terme l'onconasa i també pel seu plegament, ja que aquest residu es plega contra l'hèlix α de l'extrem N-terminal formant ponts d'hidrogen amb el nitrogen de la cadena lateral de la Lys9 i amb el grup carbonil de la Val96, situada al full β de l'extrem C-terminal. El centre actiu de l'enzim es localitza en la unió de l'hèlix α1 amb dos fulls β, i gràcies a la unió per ponts d'hidrogen esmentada abans, Pyr és capaç d'alinear Lys9 per a la catàlisi.
Hi ha altres interaccions i enllaços que contribueixen a formar l'estructura terciària a part del plegament de N-terminal. Des de Gly100 a Cys104 es forma una estructura plegada sobre el mateix pla que la fulla β (β2, β5, β6) que s'enllaça per diversos ponts d'hidrogen i pel pont de disulfur Cys87-Cys104. També per ponts d'hidrogen el grup CO de la Val96 fa que hèlix α1 quedi replegada sobre l'onconasa, fent que N-terminal passi a formar part del centre actiu de l'enzim. Els girs de l'estructura secundària tenen la llargària mínima per poder preservar correctament l'estructura terciària, i òbviament unir els elements de l'estructura secundària.
Hi ha estudis que han demostrat que l'eliminació del residu 104 de l'extrem C-teminal fa que hi hagi una pèrdua d'estabilitat considerable (ΔT½=19 °C). A més a més, un altre grup d'investigadors van veure que eliminant el pont de disulfur que connecta amb aquest aminoàcid també provocava una desestabilització significativa (ΔT½ = 30 °C). Finalment, es va trobar que la presència d'una metionina a l'extrem N-terminal, impedint la ciclació de la glutamina a piroglutàmic, promou una reducció de l'estabilitat no tan marcada (ΔT½ = 3 °C)
Funcionament Les funcions principals de l'Onconassa són l'activitat citotòxica i citostàtica. És un catalitzador feble, però tot i això les seves activitats enzimàtiques són necessàries per poder dur a terme els processos anteriors. A pH 6,0 l'Onconasa presenta activitat òptima, i la seva activitat s'inhibeix amb l'aniquilació dels seus residus d'histidina i amb la metilació reductiva, la qual cosa porta a una derivatització dels residus de lisina. També presenta resistència a l'inhibidor de la ribonucleasa dels mamífers (RI).
En un principi, es va postular que l'ARNt era el substrat principal de l'Onconasa in vivo, però a mesura que s'han dut a terme diverses investigacions sobre la proteïna en qüestió, també hi ha una àmplia evidència que suggereix que altres espècies d'ARN, en particular els micro ARN, poden ser realment l'objectiu crític d'aquestes ribonucleases. Els micro-RNA estan implicats en la regulació de l'expressió gènica mitjançant l'RNA d'interferencia (RNAi). Depenent del grau de complementarietat del micro-RNA amb el ARNm, els micro-RNA poden o inhibir la traducció del ARNm o bé induir la seva degradació.
A més es va demostrar que l'Onconasa és fortament cooperativa quan es combina amb altres modalitats antitumorals, gràcies a aquestes podrà augmentar la seva capacitat citotòxica i citostàtica.
L'Onconasa és una molècula altament catiònica i la seva toxicitat preferent cap a les cèl·lules canceroses (que tenen una càrrega negativa més alta en comparació amb les cèl·lules normals, i això facilita les interaccions electroestàtiques amb aquesta proteïna molt bàsica) pot dependre d'una major eficiència d'unió a la superfície cel·lular.
Activitat citostàtica Els efectes citostàtics de l'Onconasa es manifesten com una aturada cel·lular en la fase del cicle cel·lular G(1).