MALDI

náhled|vpravo|200px|MALDI-TOF hmotnostní spektrometr

Matricí asistovaná laserová desorpce/ionizace (zkráceně MALDI) je metoda ionizace, při které se využívá matrice absorbující energii laseru k tvorbě iontů z velkých molekul za minimální fragmentace. Používá se na analýzu biomolekul, například DNA, bílkovin, peptidů a sacharidů) a velkých organických molekul, jako jsou polymery a dendrimery, které jsou nestabilní a při použití jiných způsobů ionizace u nich dochází k fragmentaci. Podobá se elektrosprejové ionizaci (ESI) tím, že u obou metod je nízká míra fragmentace, a také způsobem tvorby iontů z velkých molekul v plynné fázi, u MALDI obvykle vzniká méně iontů s vícenásobnými náboji.

Provedení MALDI se skládá ze tří kroků. Nejprve se vzorek smíchá s vhodnou látkou nebo směsí tvořící matrici a aplikuje na kovovou destičku. Poté se vzorek ozáří pulzním laserem, čímž se vyvolá ablaci a desorpci vzorku a matrice. Nakonec se molekuly analytu ionizují protonací nebo deprotonací v proudu horkých ablatovaných plynů a analyzují hmotnostním spektrometrem.

Historie Označení matricí asistovaná laserová desorpce/ionizace (MALDI) se začalo používat v roce 1985. Franz Hillenkamp, Michael Karas a další zjistili, že aminokyselina alanin může být snadněji ionizována, jestliže je smíchána s tryptofanem a ozářena pulzním 266nm laserem. Tryptofan pohlcuje energii laseru a usnadňuje ionizaci neabsorbujícího alaninu. Tímto způsobem lze ionizovat peptidy s molekulovou hmotností až 2843 Da, jako je například melitin. V roce 1987 Kóiči Tanaka se svými spolupracovníky použil metodu „ultratenkého kovu a kapalné matrice“ kombinující 30nm částice kobaltu v glycerolu s 337nm dusíkovým laserem. Touto metodou mohou být ionizovány biomolekuly s molekulovými hmotnostmi až 34 472 Da, což je například karboxypeptidáza A. Tanaka se v roce 2002 stal spoludržitelem Nobelovy ceny za chemii díky tomu, že ukázal, že vhodnou kombinací vlnové délky laseru a složení matrice lze ionizovat bílkoviny. Karas a Hillenkamp následně dokázali ionizovat 67kDa bílkovinu albumin pomocí matrice z kyseliny nikotinové a 266nm laseru.

Dalších pokroků bylo dosaženo pomocí 355nm laseru a matric obsahujících deriváty kyseliny skořicové, kterými byly kyselina ferulová, kyselina kávová a kyselina sinapová. Dostupnost malých a nepříliš nákladných dusíkových laserů poskytujících záření s vlnovou délkou 337 nm a první přístroje uvedené na trh začátkem 90. let 20. století umožnily větší využití MALDI ve výzkumu. V současnosti se nejčastěji používají organické matrice.

Matrice + Seznam matric pro MALDI Sloučenina Ostatní názvy Rozpouštědlo Vlnová délka (nm) Použití kyselina 2,5-dihydroxybenzoová DHB, kyselina gentisová acetonitril, voda, methanol, aceton, chloroform 337, 355, 266 peptidy, nukleotidy, oligonukleotidy, oligosacharidy kyselina 3,5-dimethoxy-4-hydroxyskořicová kyselina sinapová acetonitril, voda, aceton, chloroform 337, 355, 266 peptidy, bílkoviny, lipidy kyselina 4-hydroxy-3-methoxyskořicová kyselina ferulová acetonitril, voda, propanol 337, 355, 266 bílkoviny kyselina α-kyano-4-hydroxyskořicová acetonitril, voda, ethanol, aceton 337, 355 peptidy, lipidy, nukleotidy Kyselina pikolinová ethanol 266 oligonukleotidy kyselina 3-hydroxypikolinová ethanol 337, 355 oligonukleotidy

Matrice obsahuje krystalizované molekuly, nejčastěji se používají kyselina sinapová, alfa-kyano-4-hydroxyskořicová a 2,5-dihydroxybenzoová. Roztok jedné ze tří uvedených sloučenin se obvykle připravuje z ultračisté vody a organického rozpouštědla, jakým je například acetonitril nebo ethanol. Často se do roztoku přidává zdroj [M+H] protiiontů, například kyselina trifluoroctová. A Příkladem roztoku může být 20 mg/ml kyseliny sinapové ve směsi acetonitrilu, vody a kyseliny trifluoroctové v poměru 50:50:0,1.

vlevo|náhled|250px|Znázornění pozic substituce u kyseliny skořicové

Hledání vhodných složek matrice je často založeno na pokusu a omylu, ovšem s uvážením potřeby určitých vlastností molekul. Ty by měly mít nižší molekulové hmotnosti (aby se snadno odpařovaly) ale měly by být dostatečně velké (a tedy mít nízký tlak syté páry), aby se nevypařovaly během přípravy vzorku. Často jde o kyseliny, takže se deprotonizují a tím pomáhají ionizovat analyt. Byly však popsány i zásadité matrice. Matrice by měly vykazovat silnou absorpci v ultrafialové nebo infračervené oblasti, aby rychle a účinně zachycovaly laserové paprsky. Taková absorpce se většinou vyskytuje u sloučenin, jejichž molekuly obsahují konjugované systémy dvojných vazeb, jaké má například kyselina skořicová. Na tyto systémy bývají navázány polární skupiny, díky kterým lze dané látky použít ve vodných roztocích. Často obsahují chromoforové skupiny.

Roztok matrice se smíchá s analytem. Voda s organickým rozpouštědlem umožní rozpuštění hydrofobním i hydrofilním) molekulám. Připravený roztok se aplikuje na MALDI destičku (která je obvykle kovová). Rozpouštědlo se odpaří a zbude jen rekrystalizovaná matrice, ve které se nacházejí molekuly analytu, dochází tedy ke kokrystalizaci. Kokrystalizace je jedním z důležitých hledisek při výběru matrice, protože vhodná matrice umožňuje získat dobré spektrum zkoumaného analytu.

Při analýze biologických systémů anorganické soli, které také bývají obsaženy v bílkovinných extraktech, narušují ionizaci. Odstraněny mohou extrakcí v pevné fázi nebo vymytím chladnou vodou; tyto postupy je možné použít i k odstranění ostatních látek ze vzorku. Směs matrice a proteinu není homogenní, protože rozdíly v polaritě způsobují oddělování obou složek během kokrystalizace.

náhled|vpravo|Naftalen a jemu podobné sloučeniny mohou být rovněž použity k ionizaci vzorku.

Matrici lze použít k tomu, aby k ionizaci docházelo různými způsoby. K ionizaci se, jak je uvedeno výše, nejčastěji používají acidobazické reakce, molekuly s konjugovanými pí systémy, například naftaleny, také mohou fungovat jako akceptory elektronů a tak být použity jako matrice pro MALDI/TOF. Tato vlastnost je výhodná při analýze molekul, které také obsahují konjugované pí systémy. Nejvíce se takovéto matrice používají při zkoumání porfyrinových sloučenin, jako jsou chlorofyly. Mají lepší ionizační vlastnosti a neobjevují se u nich nevhodné způsoby fragmentace nebo dokonce ztráty postranních řetězců. Konjugované porfyriny mohou být použity samy o sobě jako matrice, díky čemuž není nutné používat zvláštní sloučeniny na přípravu matric.

Přístroje náhled|Znázornění přístroje na MALDI-TOF; ionizovaná matrice vzorku se odděluje od povrchu. Vzorek putuje do hmotnostního analyzátoru a je následně analyzován.

Existuje několik variant MALDI přístrojů; podobná zařízení mohou být použita k odlišným účelům. Hmotnostní spektrometrie se vyvinula do podoby hmotnostní spektrometrie s velmi vysokým rozlišením, jako jsou FT-ICR a další. Mnoho MALDI-MS lze zakoupit s výměnným ionizátorem (například elektrosprejovým, MALDI nebo APCI), a tak mohou být použity i měkké ionizační metody.

Laser MALDI metody obvykle zahrnují použití ultrafialových laserů, například dusíkových (337 nm) a Nd:YAG laserů (355 nebo 266 nm).

Infračervené lasery používané s  MALDI mívají vlnové délky 2,94 μm (Er:YAG laser) a 10,6 μm CO2 laser. Infračervené lasery nejsou běžné; používají se díky nižší míře fragmentace při ionizaci.

Infračervená MALDI se rovněž vyznačuje lepším odstraňováním materiálu (což je výhodné u biologických vzorků), menším nízkohmotnostním rušením a kompatibilitou s bezmatricovými laserově desorpčními metodami hmotnostní spektrometrie.

Spektrometr náhled|vpravo|300px|Destička na aplikaci vzorku u MALDI hmotnostní spektrometrie

Na MALDI nejčastěji napojovaným druhem hmotnostního spektrometru je hmotnostní spektrometr doby letu (TOF-MS), protože jej lze použít v širokém rozmezí molekulových hmotností. TOF se nejlépe hodí k MALDI, protože pulzní laser vypouští jednotlivé dávky záření namísto souvislého proudu. MALDI-TOF přístroje často mají reflektron („iontové zrcadlo“), který odráží ionty pomocí elektrického pole, čímž se prodlužuje dráha iontů a tím i rozdíl časů letu u iontů s rozdílnými hodnotami m/z a dochází i k vylepšení rozlišení. Moderní reflektronové TOF přístroje dosahují rozlišení m/Δm 50 000 FWHM a někdy i vyššího.

MALDI je také možné použít jako zdroj iontů pro IMS-TOF MS k identifikaci fosforylovaných a nefosforylovaných peptidů.

MALDI-FT-ICR MS je také vhodnou metodou tam, kde je potřeba vysoké rozlišení MALDI-MS analýz.

MALDI za atmosférického tlaku Matricí asistovaná laserová desorpce/ionizace za atmosférického tlaku (AP-MALDI) ke metoda ionizace, která je protipólem vakuové MALDI fungujícím za atmosférického tlaku.

Hlavním rozdílem mezi vakuovou a AP-MALDI je tlak v prostředí, ve kterém se tvoří ionty. Při vakuové MALDI ionty vznikají za tlaků kolem 1 Pa i nižších, zatímco u AP-MALDI za atmosférického tlaku. V minulosti měl tento postup nevýhodu oproti vakuové MALDI v podobě nízké citlivosti; ionty ovšem lze přemístit do hmotnostního spektrometru a byly popsány meze detekce v řádu attomolů. AP-MALDI MS má využití v mnoha oblastech od proteomiky přes analýzu DNA, RNA, PNA, lipidů, oligosacharidů, fosfopeptidů, bakterií, malých molekul a syntetických polymerů k vývoji léčiv; podobné využití nacházejí také vakuové MALDI přístroje. AP-MALDI iontový zdroj lze lehce spojit s hmotnostní spektrometrií iontové pasti nebo ESI.

Aerosolová MALDI Při aerosolové hmotnostní spektrometrii laserové paprsky ionizují jednotlivé kapky vzorku; odpovídající přístroje se nazývají jednočásticové hmotnostní spektrometry. Do vzorku lze před aerosolizací přidat MALDI matrici.

Mechanismus ionizace Laserové paprsky dopadají na krystaly matrice v kapce. Matrice pohlcuje energii laseru a dochází k desorpci a ionizaci. Vytvořená mlha obsahuje neutrální, ionizované, protonované i deprotonované molekuly matrice a nanokapky. Tyto částice se podílí na ionizaci analytu, přesná podoba mechanismu však není známa. Následně matrice předává protony molekulám analytu (například bílkoviny), čímž mu dodává elektrický náboj. Ionty pozorované po tomto procesu jsou původní molekuly [M], u kterých došlo k odštěpení nebo zachycení iontu. MALDI umožňuje tvorbu iontů s jednoduchými i vícenásobnými náboji ([M+nH]n+), a to v závislosti na vlastnostech matrice, vydatnosti laseru a použitém napětí.

Model přenosu protonů v plynné fázi, zavedený jako fyzikálně-chemický model, zahrnuje primární i sekundární ionizační jevy.

Primární procesy spočívají v oddělení náboje absorpcí fotonů v matrici a uvolněném energie za vzniku matricových iontových párů. Primární tvorba iontů probíhá skrz absorbování ultrafialových fotonů a vytváření excitovaných molekul podle těchto rovnic:

S0 + hν → S1S1 + S1 → S0 + Sn S1 + Sn → M+ + M−

kde S0 je základní stav, S1 první excitovaný stav a Sn vyšší excitovaný stav. Ionty mohou vznikat přesunem protonů nebo elektronů, což je vyjádřeno symboly M+ a M−. K sekundárním dějům patří reakce iontů a molekul za tvorby iontů analytu.

Podle tepelného modelu vysoké teploty vyvolávají přenos protonů mezi matricí a analytem v kapalné matrici. Důležitým parametrem ověřujícím správnost modelu je poměr množství iontů a neutrálních molekul, chyba v určení tohoto poměru může vést k nesprávnému určení mechanismu ionizace. Model předpovídá nárůst iontové intenzity s koncentrací, protonovou afinitou analytů, a frekvence laserových záblesků. Podle tohoto modelu se adukty kovových iontů (například [M+Na]+ nebo [M+K]+) tvoří převážně tepelně podněcovaným rozpouštěním solí.

Při matricí asistované ionizaci (MAI) se připravuje matrice podobně jako u MALDI, ovšem k tvorbě iontů analytu není potřeba laserová ablace. Samotným vystavením matrice a analytu vakuovému prostředí hmotnostního spektrometru vznikají ionty téměř stejné jako při elektrosprejové ionizaci. Pravděpodobně existují mechanistické souvislosti mezi tímto procesem a MALDI.