náhled|Proteiny a jejich interakce Metody výzkumu protein-proteinových interakcí umožňují detekovat a hlouběji zkoumat interakce mezi rozmanitými proteiny. I přesto, že nukleotidová sekvence lidského genomu byla již zcela vyřešena, doposud nejsou známy funkce některých v ní zakódovaných proteinů. Funkci proteinu lze dobře zjistit, pokud se podaří odhalit jeho interakční partnery. Zároveň variabilita protein-proteinových interakcí, jejich regulace v čase a prostoru se podílejí na komplexitě celé řady dějů v organismech. K účelu výzkumu protein-proteinových interakcí byla (a stále je) vyvíjena celá paleta metod. Každá z nich má své výhody i nevýhody a je vhodná pro určitý typ proteinu.
Základní rozdělení metod výzkumu protein-proteinových interakcí (PPI) je: metody, které umožňují interakci objevit metody, které umožňují zjištěnou interakci ověřit/potvrdit a lépe charakterizovat (např. Kd, kvantifikace, stechiometrie, struktura…) V souvislosti s výzkumem PPI se užívá pojmu „bait“ (návnada) pro protein, který je studován a jehož interakční partneři jsou předmwětem zájmu. „Prey“ (dravec) označuje ony interakční partnery. Cílem metody je zjednodušeně „nalákat dravce na návnadu, chytit ho a identifikovat“.
Metody detekce PPI Detekovat nové PPI umožňují zejména metody afinitní purifikace, ko-imunoprecipitace, kvasinkový dvouhybridový systém a podobné komplementační metody, proteinové čipy (array), blízkostí indukovaná ligace či značení.
Pro všechny tyto metody je typická nízká specificita, výsledkem je značné množství tzv. false-pozitiv výsledků. Je proto třeba detekované interakce vždy ověřit nějakou specifičtější metodou. Nelze ji využít už na začátku, neboť je pro ni potřebné znát potenciální interakční patnery, zatím neznámé. Metody detekce PPI jsou primárním screeningem, který umožní vyloučit obrovské množství potenciálních interakčních partnerů a vytipuje užší skupinu, kterou je možné dále analyzovat. náhled|Princip afinitní purifikace
Afinitní purifikace (AP) Tato metoda může být aplikována jak v in vivo, tak v in vitro podobě. Je relativně nenáročná, levná, nízkoprůchodná – tzn. hodí se pro analýzu jednotlivých proteinů, nikoliv na detekci celého interaktomu. Má nízkou specificitu i senzitivitu – detekovány jsou převážně stabilní, silné interakce. Senzitivitu je možné zvýšit při in vitro provedení.
In vitro varianta Zkoumaný protein (návnada) je připojen na pevnou matrici (agarózové/magnetické kuličky). Může být připojen kovalentně, či vysokoafinní nekovalentní vazbou (například přes protilátku). Následně se aplikuje směs buněčných proteinů na matrici s návnadou. Ty proteiny, které s návnadou interagují, se na ní zachytí. Zbytek neinteragujících proteinů se odmyje. Dalším krokem je eluce proteinů, které se na návnadu chytily, obvykle pomocí roztoku s vysokou koncentrací solí, detergentem, či molekulou kompetující o vazbu návnady. Eluované proteiny je nakonec potřeba identifikovat – typicky pomocí hmotnostní spektrometrie.
Tato metoda má jeden značný problém – proteiny interagují v nefyziologických podmínkách. Výsledné interakce mohou být tedy pouze důsledkem denaturace proteinu během izolace, nebo se k sobě dostanou proteiny vyskytující se běžně ve zcela odlišných buněčných kompartmentech.
Zvýšit senzitivitu metody je možné prostřednictvím vysoké koncentrace zkoumaného proteinu zájmu na matrici. V takovém případě je možné zachytit i relativně slabé a transientní interakce.
In vivo varianta Cílem in vivo afinitní purifikace je izolovat skutečné, fyziologické interakční komplexy, ve kterých se vyskytuje zkoumaný protein v buňce. Za tím účelem je typicky geneticky modifikován – připojí se k němu určitá značka, s jejíž pomocí ho lze snadno izolovat včetně jeho interakčních partnerů (His tag, FLAG, Myc, HA, GFP, GST, PrA). Nebo není nemodifikován a izolace se provádí pomocí specifických protilátek. Proces purifikace je v principu stejný jako v in vitro případě, opět je použita pevná matrice, na které jsou připojeny specifické protilátky či jiné vysokoafinní molekuly. Ty nekovalentní vazbou zachytí zkoumaný protein společně s jeho interakčními partnery. Nespecifické interakce jsou odmyty a to co zůstane, lze eluovat a identifikovat hmotnostní spektrometrií.
Hlavní rozdíl od in vitro metody je tedy v tom, odkud přichází zkoumaný protein. V in vitro případě musí být nejprve purifikován a připojen na matrici. V in vivo případě je společně s ostatními proteiny součástí buněčného lyzátu a na matrici se váže později, rovnou ve svém komplexu interakčních partnerů.
Proteinové značky Využití protilátek, které zachytí neznačené endogenní proteiny má své výhody – není potřeba nic klonovat, protein je exprimován ve fyziologickém množství a podobě. Jen malé množství dostupných protilátek je ale vskutku specifické.
Z toho důvodu je častější využití proteinových značek, ke kterým existují skvělé protilátky či jiní vysokoafinní partneři, zaběhnuté protokoly. Nezáleží pak tolik na charakteru zkoumaného proteinu a s vysokou pravděpodobností ho lze bez problémů izolovat. Slabinou tohoto přístupu je exprese fúzního proteinu (zkoumaný protein-značka). Značka může měnit vlastnosti proteinu a fúzní protein je exprimován z nefyziologického promotoru. V důsledku je ho v buňce víc, než by mělo a to může vyústit v nefyziologické interakce. Při použití tohoto přístupu je tedy třeba ověřit, že fúzní protein se chová zcela fyziologicky, a zajistit jeho nízkou expresi.
Proteinové značky mohou být krátké aminokyselinové úseky – FLAG, HA, Myc, nebo se může jednat o celé proteiny – GFP, GST. Krátké značky obvykle nijak nevadí funkci proteinu, lze jich umístit i víc za sebou a zvýšit tak účinnost izolace. GFP je sice velkou značkou a vadit funkci proteinu může, ale přináší možnost značený protein pozorovat in vivo v buňkách díky fluorescenci. náhled|Ko-imunoprecipitace
Ko-imunoprecipitace (co-IP) Metoda je hodně podobná afinitní purifikaci. Do buněčného lyzátu se přidá protilátka specifická ke zkoumanénu proteinu. Následně se přidá sekundární protilátka či protein A připojené na agarózu. Zkoumaný protein společně se svými interakčními partnery se zachytí na agaróze a vzniká imunoprecipitát. Vzorek se promyje, imunoprecipitáty lze snadno oddělit centrifugací.
Imunoprecipitát lze nakonec analyzovat pomocí hmotnostní spektrometrie.
Kvasinkový dvouhybridový systém
Jedná se o náročnější, senzitivní, genetickou, in vivo metodu. Detekuje se exprese určitého kvasinkového markeru (např. β galaktosidázy), která je spouštěna funkčním transkripčním faktorem. Transkripční faktory mají dvě důležité domény, bez nichž nemohou fungovat – transaktivační a DNA-vazebnou. DNA-vazebná doména je fúzována se zkoumanýn proteinem, transaktivační doména s potenciálním interakčním partnerem. Pouze pokud proteiny interagují, domény se dostanou k sobě a spouští expresi markeru, kterou je možné detekovat. Existují velké knihovny expresních vektorů s fúzemi rozmanitých proteinů k doménám transkripčních faktorů a lze proto simultánně testovat spoustu potenciálních proteinových interakcí. Metoda je vhodná i pro analýzu komplexních interaktomů. náhled|Kvasinkový dvouhybridový systém Nevýhod tohoto systému je několik. K interakci proteinových partnerů musí dojít v jádře, aby transkripční faktor fungoval. Metodu proto nelze použít pro proteiny membránové a vyskytující se v jiných buněčných kompatmentech. Kvasinky neumí vytvářet posttranslační modifikace stejné jako savčí buňky – pokud je tedy interakce založena na savčí modifikaci, v kvasince k interakci nedojde. Navíc fúze přídatné domény k proteinu může pozměnit jeho vlastnosti. Typická je také velmi nízká specifita, vedoucí ke vzniku velkého množství false-pozitiv výsledků.
V důsledku slabin tradiční metody bylo odvozeno velké množství vylepšených přístupů, například: Rekrutace proteinu Sos (son of sevenles) / Ras vhodné pro cytoplazmatické proteiny G proteinový fúzní systém vhodné pro interakci mezi membránovým (návnada) a cytoplazmatickým proteinem Savčí dvouhybridový systém fyziologické podmínky, savčí modifikace, folding A další…
Proteinové čipy Jedná se relativně drahou, složitou, vysoko-průchodnou in vitro metodu. Umožňuje analyzovat opravdu velké množství proteinových interakcí zároveň. Fungují analogicky jako DNA čipy. Kromě studia interakcí s proteiny je lze použít také k detekci interakcí s oligonukleotidy.
Proteinové čipy se skládají z pevné matrice, na níž jsou ukotveny stovky až tisíce různých proteinů. Na jednom čipu se tak může nacházet celý proteom daného organismu. Nejnáročnější je tvorba čipu. Jednotlivé proteiny je potřeba vypurifikovat z buněk, nebo je in vitro syntetizovat. Pomocí in vitro syntézy je možné přepsat celou cDNA knihovnu do podoby čipu. Vazba interakčního partnera na čip je detekována typicky fluorescenčně.
Slabinou čipů je, že se jedná o in vitro proces. Imobilizace proteinů na matrici může ovlivnit jejich strukturu a interakční vlastnosti. Navíc pokud jsou proteiny syntetizovány in vitro, nebo exprimovány v bakteriálním systému, nebudou posttranslačně modifikovány.
Blízkostí indukovaná ligace Tato metoda umožňuje kovalentně provázat proteinový komplex in vivo, v buňce. Díky tomu je možné zachytit i proteiny interagující slabě, či pouze dočasně se zkoumaným proteinem. Pevně svázaný komplex pak lze izolovat třeba pomocí afinitní purifikace a analyzovat na hmotnostním spektrometru. Díky kovalentnímu provázání při izolaci „neodpadne“ žádný z interagujících proteinů a tak lze intenzivně promývat a zbavit se pozadí.
Ke kovalentnímu propojení se používá obvykle bifunkčních činidel, kdy dvě reaktivní funkční skupiny jsou odděleny řetízkem (linkerem) určité délky. Délka řetízku určuje maximální vzdálenost, ve které je možné proteiny propojit. Reaktivní skupiny mohou být různého typu a cílit tak na konkrétní aminokyseliny proteinu – typicky jsou propojovány amino- a sulfhydrylové skupiny. Některá činidla jsou UV-aktivovatelná a ligaci je tak možné spustit v konkrétní čas. Jiná prochází samovolně přes membrány a buňky není třeba permeabilizovat.
Provazování proteinů, které jsou v blízkosti zkoumaného proteinu, s sebou nese nebezpečí propojení pouze náhodně „kolemjdoucích“ proteinů.
Blízkostí indukované značení Podobně jako předchozí metoda je blízkostí indukované značení zacíleno na zachycení všech interakcí zkoumaného proteinu, včetně slabých a transientních in vivo. Je založena na fúzi zkoumaného proteinu k enzymu, který připojí afinitní značku na proteiny v jeho bezprostředním okolí. Prostřednictvím značky je následně snadné označené interakční partnery vyizolovat a analyzovat na hmotnostním spektrometru. Tuto metodu lze dobře použít i pro membránové proteiny, které lze jen těžko solubilizovat. Nevýhodou je opět značení všech proteinů do určité vzdálenosti, tedy ne nutně pouze těch, které s naším proteinem opravdu interagují.
Jako afinitní značka je užíván zejména biotin. Biotinylace je v savčích buňkách vzácnou modifikací, navíc afinita biotinu k avidinu umožňuje snadnou izolaci. Některé enzymy vyloženě katalyzují připojení biotinu – tzv. biotin-ligázy, jiné tvoří reaktivní biotinové molekuly, které se následně ochotně vážou na aminokyseliny ve svém okolí. Dvěma nejznámějšími metodami jsou BioID (biotin-ligáza) a APEX (askorbát-peroxidáza).
Další metody pro analýzu protein-proteinových interakcí náhled|FRET V okamžiku, kdy jsou známé dva potenciální interakční partneři, nabízí se nepřeberné množství metod, jimiž je lze dále studovat a ověřovat.
Skvělou metodou je v tomto směru FRET (Försterův rezonanční přenos energie), či FCS (fluorescenční korelační spektroskopie), které umožňují pozorovat proteinový komplex pomocí fluorescence in vivo v buňkách, v reálném čase. FRET navíc umožňuje určení například KD komplexu.