Chemoproteomika zahrnuje širokou škálu technik používaných k identifikaci a zkoumání interakcí mezi proteiny a malými molekulami. Chemoproteomika doplňuje fenotypové objevování léčiv, jehož cílem je objevovat "hlavní" sloučeniny ("lead compounds") na základě změny určitého fenotypu (onemocnění). Tento přístup je opačný od "objevování léčiv na základě (biologického) cíle" (reverzní farmakologie), při němž jsou sloučeniny chemické knihovny screenovány proti předem vybranému biologickému cíli, který způsobuje onemocnění. Vzhledem k tomu, že fenotypové testy pro objevování léčiv neposkytují potvrzení mechanismu účinku sloučeniny, poskytuje chemoproteomika cenné následné strategie pro zúžení potenciálních cílů a případné potvrzení mechanismu účinku molekuly. Chemoproteomika se také snaží řešit problém, který je při objevování léků s malými molekulami spojen s promiskuitou léčiv, a to analýzou interakcí mezi proteiny a malými molekulami v měřítku celého proteomu. Hlavním cílem chemoproteomiky je charakterizovat interaktom kandidátů na léčiva a získat tak přehled o mechanismech toxicity dané interakcí sloučeniny s nežádoucím cílem ("off-target toxicity") a polyfarmakologie.
Chemoproteomické metody lze rozdělit do tří základních typů. Přístupy prováděné v roztoku zahrnují použití analogů léčiv, které chemicky modifikují cílové proteiny v roztoku a označují je pro identifikaci. Přístupy založené na imobilizaci se snaží izolovat potenciální cíle nebo ligandy ukotvením jejich vazebných partnerů na "nepohyblivém" nosiči. Přístupy bez derivatizace se snaží odvodit interakce mezi léčivem a cílem pozorováním změn stability proteinu nebo chromatografie léčiva po jeho navázání. Výpočetní techniky doplňují soubor chemoproteomických nástrojů jako paralelní linie důkazů podporující potenciální dvojice léčivo-cíl a používají se k vytváření strukturních modelů, které slouží jako informace pro optimalizaci hlavních látek. Pomocí chemoproteomiky bylo identifikováno několik cílů vysoce významných léčiv a neustálé zlepšování citlivosti hmotnostních spektrometrů a technologie chemických sond naznačuje, že chemoproteomika bude hrát velkou roli v budoucím objevování léčiv.
Princip
Kontext náhled|414x414pixelů|Příklad kvantitativního proteomiky. Proteinové extrakty z různých vzorků se extrahují a štěpí pomocí trypsinu. Oddělené vzorky se označí pomocí jednotlivých izobarických tandemových hmotnostních značek (TMT) a poté se označené vzorky spojí. Původ každého peptidu ve vzorku lze rozeznat podle připojeného TMT. Označené peptidy jsou poté detekovány a fragmentovány pomocí LC-MS/MS a kvantifikovány porovnáním relativního množství fragmentů TMT v každém hmotnostním spektru. Tento obrázek byl převzat z webu BioRender.com. Závěr projektu rozluštění lidského genomu byl provázen nadějí na nové paradigma v léčbě nemocí. Mnoho smrtelných a těžko řešitelných onemocnění se podařilo zmapovat ke konkrétním genům, což poskytlo východisko pro lepší pochopení role jejich proteinových produktů v nemoci. Při objevování léků se využívaly zvířecí knock-out modely, které poukazovaly na dopad absence proteinu, zejména při rozvoji onemocnění, a medicinální chemici využívali výpočetní chemii k vytváření sloučenin s vysokou afinitou proti proteinům způsobujícím onemocnění. Přesto počet schválených léků úřadem FDA v posledním desetiletí klesá. Jedním z možných zdrojů neúspěchu při schvalování léků je nesoulad mezi včasným a pozdním objevováním léků. Časné objevy léčiv se zaměřují na genetické ověření cíle, což je silný prediktor úspěchu, ale systémy využívající buď vyřazení genu ("knock-out genu"), či jeho nadměrnou expresi ("overexprese genu") jsou zjednodušující. Prostorově a časově podmíněné knock-out/knock-in systémy zlepšily úroveň nuancí při analýze funkce proteinů in vivo, ale stále nedokážou zcela paralelně postihnout systémovou šíři farmakologického účinku. Například léčiva často působí více mechanismy a často fungují nejlépe tak, že se na cíle podílejí částečně. Chemoproteomické nástroje nabízejí řešení, jak překlenout propast mezi genetickým chápáním nemoci a farmakologickým chápáním účinku léků tím, že identifikují mnoho proteinů, které se podílejí na terapeutickém úspěchu.
Základní nástroje Soubor chemoproteomických nástrojů je založen na kvantitativní proteomice založené na kapalinové chromatografii a tandemové hmotnostní spektrometrii (LC-MS/MS nebo LC-MS), která umožňuje téměř úplnou identifikaci a relativní kvantifikaci komplexních proteomů v biologických vzorcích. Kromě proteomické analýzy je možné detekovat také posttranslační modifikace, jako je fosforylace, glykosylace, acetylace a nově také ubikvitinace, které umožňují nahlédnout do funkčního stavu buňky. Převážná většina proteomických studií se analyzuje pomocí orbitrapových hmotnostních spektrometrů s vysokým rozlišením a vzorky se zpracovávají pomocí zobecnitelného pracovního postupu. Standardní postup začíná lýzou vzorku, při níž se proteiny extrahují do denaturačního pufru obsahujícího soli, činidlo redukující disulfidové vazby, jako je diothiothreitol, a alkylační činidlo, které blokuje thiolové skupiny, jako je jodoacetamid. Denaturované proteiny se proteolyzují, často trypsinem, a poté se před analýzou pomocí LC-MS/MS oddělí od ostatních složek směsi. Pro přesnější kvantifikaci lze různé vzorky zreagovat s izobarickými tandemovými hmotnostními značkami (TMT), což je forma chemického čárového kódu, který umožňuje multiplexování vzorků, a poté je spojit.
Metody v roztoku náhled|380x380pixelů|Sonda pro profilování proteinů na základě aktivity (ABPP). Reaktivní skupina (fialově) a reportérová značka (červeně) jsou vzájemně propojeny spojkou (černě). Reaktivní skupina se kovalentně váže do aktivního místa enzymu a reportérová značka se používá k obohacení nebo detekci značeného proteinu. Fluorofosfonát-biotin, obsahující biotin pro imobilizaci/obohacení, je příkladem sondy založené na aktivitě, která se zaměřuje na serinové hydrolázy. Tento obrázek byl vytvořen pomocí programu BioRender.com. Široké proteomické a transkriptomické profilování vedlo k nesčetným pokrokům v biomedicíně, ale charakterizace exprese RNA a proteinů má omezenou schopnost informovat o funkčních vlastnostech proteinů. Vzhledem k tomu, že informace o expresi transkriptů a proteinů zanechávají mezery ve znalostech týkajících se vlivu posttranslačních modifikací a interakcí protein-protein na aktivitu enzymů a že aktivita enzymů se liší v různých typech buněk, chorobných stavech a fyziologických podmínkách, jsou k profilování aktivity enzymů v různých kontextech zapotřebí specializované nástroje. Kromě toho mnoho identifikovaných enzymů nebylo dostatečně charakterizováno, aby bylo možné získat použitelné mechanismy, na nichž by bylo možné založit funkční testy. Bez základu pro funkční biochemické odečty jsou k detekci interakcí mezi léky a proteiny zapotřebí chemické nástroje.
Profilování proteinů založené na aktivitě (ABPP) Profilování proteinů založené na aktivitě ("Activity-Based Protein Profiling", ABPP; či proteomika založená na aktivitě) je technika, která byla vyvinuta ke sledování dostupnosti enzymatických aktivních míst pro jejich endogenní ligandy. ABPP používá speciálně navržené sondy, které vstupují do aktivního místa enzymu a vytvářejí s ním kovalentní vazbu, což potvrzuje, že enzym je v aktivním stavu. Sonda je obvykle analogem léčiva, jehož mechanismus se studuje, takže kovalentní značení enzymu svědčí o vazbě léčiva. Sondy ABPP jsou navrženy se třemi klíčovými funkčními jednotkami: (1) reaktivní skupina, (2) reportérová značka (např. biotin nebo rhodamin), a (3) chemická spojka mezi oběma skupinami. Reaktivní skupina je elektrofil, který kovalentně modifikuje serinový, cysteinový nebo lysinový zbytek v aktivním místě enzymu a zabraňuje budoucím interakcím s jinými ligandy. Sondy ABPP jsou obvykle navrženy proti enzymovým třídám, a mohou tak poskytnout informace na úrovni systému o vlivu stavu buňky na enzymové sítě. Reportérová značka se používá k potvrzení označení enzymu reaktivní skupinou a může se lišit v závislosti na následném způsobu detekce. Nejpoužívanějšími reportéry jsou fluorescenční molekuly, které umožňují zobrazování, a afinitní značky (např. biotin), které umožňují separaci označených enzymů a analýzu pomocí hmotnostní spektrometrie. Každá strategie má své nevýhody, např. fluorescenční molekuly neumožňují obohacení pro proteomickou analýzu, zatímco afinitní značky založené na biotinu se purifikují společně s endogenně biotinylovanými proteiny. K propojení reaktivní skupiny s reportérem se používá chemická "spojka" ("linker"), ideálně způsobem, který nemění aktivitu sondy. Nejběžnějšími spojkovými skupinami jsou dlouhé alkylové řetězce, derivatizované PEG a modifikované polypeptidy.
Za předpokladu, že enzymy se liší ve své struktuře, funkci a asociacích v závislosti na fyziologickém nebo vývojovém stavu systému, lze odvodit, že se bude měnit i přístupnost aktivního místa enzymu. Schopnost sondy ABPP označit enzym se proto bude rovněž lišit v závislosti na podmínkách. Vazba sondy tak může odhalit informace o funkčních vlastnostech enzymu v různých kontextech. High-content screening těží z ABPP, zejména v oblasti kompetitivních inhibičních testů, při nichž jsou biologické vzorky předem inkubovány s kandidáty na léčiva a poté "soutěží" se sondami ABPP o vazbu na cílové enzymy. Sloučeniny s vysokou afinitou k cíli zabrání vazbě sondy a stupeň vazby sondy lze použít jako ukazatel afinity sloučeniny. Protože sondy ABPP značí třídy enzymů, lze tento přístup použít také k profilování selektivity léčiv, protože vysoce selektivní sloučeniny budou v ideálním případě konkurovat sondám pouze u malého počtu proteinů. náhled|380x380pixelů| Typická fotoafinitní sonda. Jako první místo interakce mezi sondou a proteinem slouží část odvozená od léčiva (hnědě). Fotoreaktivní skupina, zde arylazid, může být aktivována světlem za vzniku reaktivního meziproduktu, který se váže s nespecifickým místem na proteinu. Značku pak lze použít k obohacení a identifikaci nebo zobrazení a detekci cíle.Tento obrázek byl vytvořen pomocí BioRender.com.
Fotoafinitní značení Na rozdíl od ABPP, která vede ke značení proteinů po navázání sondy, fotoafinitní značení sond vyžaduje aktivaci fotolýzou, než dojde ke kovalentní vazbě na protein. To umožňuje přítomnost fotoreaktivní skupiny. Tyto sondy se skládají ze tří spojených částí: (1) části odvozené od léčiva; (2) fotoreaktivní skupiny (fenylazid, fenyldiazirin nebo benzofenon); a (3) identifikační značky, jako je biotin, fluorescenční molekula nebo skupina pro click-chemii. Lékový skelet je obvykle analogem léčiva, jehož mechanismus je studován, a co je důležité, váže se na cíl reverzibilně, což lépe napodobuje interakci mezi většinou léčiv a jejich cíli. Existuje několik skupin fotoreaktivních skupin, které se však zásadně liší od sond ABPP: zatímco ABPP specificky značí nukleofilní aminokyseliny v aktivním místě cíle, fotoafinitní značení je nespecifické, a je tedy použitelné pro značení širšího spektra cílů. Identifikační značka se bude lišit v závislosti na typu prováděné analýzy: biotinové skupiny a skupiny pro click-chemii jsou vhodné pro obohacení značených proteinů před identifikací založenou na hmotnostní spektrometrii, zatímco fluorescenční barviva se používají při použití zobrazovací metody založené na gelu, jako je SDS-PAGE, pro ověření interakce s cílem. vlevo|náhled|137x137pixelů|Struktura fenylazidu. Fotoreaktivní skupina využívaná pro fotoafinitivní značení.