thumb|Espectrofotómetro
Se denomina espectrofotometría al conjunto de técnicas de análisis utilizadas para determinar la concentración de sustancias químicas en disolución mediante el empleo de energía electromagnética a longitudes de onda previamente seleccionadas. Un haz de radiación electromagnética, generalmente con longitud de onda característica de las regiones ultravioleta, visible o infrarroja, se hace pasar a través de la disolución que contiene el analito. Parte de la radiación es absorbida por las moléculas presentes y parte es trasmitida. La diferencia entre la intensidad lumínica inicial y la que finalmente llega al detector, tras atravesar la disolución, está relacionada con la concentración de la sustancia absorbente, por lo que, midiendo la absorbancia o la transmitancia puede determinarse la concentración (ley de Beer-Lambert)
Fundamento La absorción de radiación ultravioleta, visible o infrarroja tiene interés en el análisis para la identificación de especies tanto orgánicas como inorgánicas. La espectrofotometría que utiliza radiaciones electromagnéticas de las regiones ultravioleta y visible del espectro se utiliza básicamente en el análisis cuantitativo, siendo empleada extensamente tanto en los laboratorios de análisis químico como en los de análisis clínico. La espectroscopia de absorción infrarroja, especialmente la correspondiente a la región media del infrarrojo, entre aproximadamente 2,5-25 μm de longitud de onda, es una herramienta muy poderosa para la identificación y determinación de las estructuras de compuestos orgánicos e inorgánicos, aunque también desempeña una función muy importante en el análisis cuantitativo, sobre todo, en el análisis medioambiental. En la espectrofotometría se utiliza principalmente la absorción de radiación electromagnética en la zona del ultravioleta, visible e infrarroja del espectro, aunque también puede producirse absorción de radiación electromagnética en otras regiones del espectro.
La radiación electromagnética puede ser descrita tanto en términos de partículas (denominadas fotones) como de ondas (teoría dual onda-corpúsculo). Cada fotón de radiación electromagnética lleva asociado a su movimiento una cantidad energía, que depende de la frecuencia de la radiación y viene expresada mediante la conocida como ecuación de Plank:
alt=Diagrama energía molecular|miniaturadeimagen|402x402px|Diagrama de niveles de energía molecular mostrando la diferencia entre la absorción de radiación infrarroja y la ultravioleta-visible. donde es la constante de Plank (6,626 x 10-34 J·s) y es la frecuencia de la radiación en Hz. Cuando una molécula absorbe un fotón, la energía de este fotón pasa a la molécula, aumentando su energía. Se dice entonces, que la molécula ha pasado de un estado fundamental de energía a un estado excitado. Puesto que la energía de los fotones absorbidos dependen de la frecuencia de la radiación electromagnética, dependiendo de la región espectral y de la longitud de onda seleccionada, los efectos que tendrán sobre la molécula serán diferentes. Así, por ejemplo. la absorción de fotones de radiación de microondas estimula el movimiento rotacional de las moléculas. La radiación infrarroja afecta al movimiento vibracional de las moléculas cuando la absorben, mientras que las radiaciones visible y UV hacen que los electrones pasen a orbitales de mayor energía. Si los fotones son muy energéticos, es decir la radiación es de alta frecuencia, como por ejemplo, los rayos X y la radiación UV de longitud de onda corta (ultravioleta lejano), se producen cambios irreversibles en las moléculas, ya que se rompen enlaces químicos que ionizan a las moléculas, por lo que son de menor interés en el análisis cuantitativo.
En la espectrofotometría se mide la cantidad de luz absorbida como función de la longitud de onda utilizada. La absorción de las radiaciones ultravioletas, visibles e infrarrojas depende de la estructura de las moléculas, y es característica de cada sustancia química. Existen una serie de leyes fundamentales que permiten relacionar la cantidad de energía electromagnética absorbida con la concentración de las especies químicas que la absorbe. La primera de esta leyes fue formulada inicialmente por Bouguer en 1729 y posteriormente redefinida por Lambert, por lo que habitualmente se la denomina con el nombre de este último.
Ley de Lambert La ley de Lambert (o de Bouguer), en lo que a la absorción de la radiación luminosa se refiere, establece de que cada unidad de longitud de un material absorbente homogéneo (solido transparente o disolución), a través del cual pasa la luz, absorbe la misma fracción de radiación, por lo que si un haz luminoso monocromático de intensidad I se trasmite a través de dicho material, este irá perdiendo intensidad lumínica de acuerdo con la ecuación diferencial:
donde k es una constate de proporcionalidad que depende de la longitud de onda empleada, de la temperatura y del material de que esté hecho el medio absorbente y b es la distancia recorrida por el haz luminoso. El signo negativo indica que se produce una disminución de la intensidad luminosa. . La ecuación puede modificarse reordenando términos:
que una vez integrada, se obtiene la expresión matemática de la ley de Lambert de la absorción luminosa:
que también puede expresarse en notación logarítmica decimal:
La relación entre la intensidad lumínica trasmitida (I) y la inicial (I0), se conoce con el nombre de transmitancia (T) y puesto que tiene unidades de intensidad por unidad de tiempo, también es frecuente expresarla como irradiancia, P y P0.
Ley de Lambert-Beer La ley de Lambert es una ley que se cumple para cualquier medio homogéneo, sólido, líquido (incluidas las disoluciones) y gaseoso siempre que no sea dispersivo. Sin embargo, en el caso de las disoluciones químicas con sustancias absorbentes, también tiene un gran efecto sobre la variación de la intensidad luminosa del haz de radiación electromagnética, la concentración de dicha sustancia. August Beer encontró que un aumento de la concentración de sustancia absorbente produce el mismo efecto que un aumento de la longitud del paso óptico, b, en la ley de Lambert, redefiniendo dicha ley en términos de concentración:
A la inversa de la transmitancia, T la denomino absorbancia, A, de forma que la anterior ley de Lambert quedó modificada como:
con lo que, agrupando términos, queda la expresión matemática conocida como ley de Beer.
donde ahora k representa la proporcionalidad conjunta entre absorbancia y el paso óptico multiplicado por la concentración. Aunque fue Beer el que relacionó la cantidad de radiación trasmitida a través de una disolución, con la concentración de las sustancias absorbentes, al estar basada en una ley anterior, a menudo se referencia a ella como Ley de Lamber-Beer o incluso, en reconocimiento al primer científico que vislumbró la misma, como Ley de Bouguer-Lamber-Beer. Esta ley afirma que "a mayor concentración, mayor absorbancia", y que si se mantiene la distancia o recorrido óptico constante, la relación con la concentración de sustancia absorbente es lineal, aspecto este muy importante en el análisis químico cuantitativo, ya que permite determinar la concentración en disolución de aquellas sustancias que presentan algún tipo de absortividad, bien a la radiación infrarroja como a la visible o a la ultravioleta.
Finalmente, en cuanto a unidades se refiere, la absorbancia es una magnitud adimensional, sin unidades, pues proviene del cociente de una magnitud física (I o P), mientras que el paso óptico, b es frecuente expresarlo en cm, pues la mayoría de las celdas donde se coloca la muestra en los aparatos de medida apenas tienen uno o dos centímetros en el caso de la espectrofotometria ultravioleta-visible o de unos pocos milímetros en la espectrofotometría infrarroja. Si la concentración se expresa en g/L, k (a veces se sustituye por ɑ) se denomina absortividad específica y tiene unidades son L·g-1·L-1 y si se expresa en unidades internacionales, M, se sustituye k (o ɑ) por ɛ (epsilon) y la magnitud recibe el nombre de absortividad molar, siendo sus unidades M-1·cm-1. Como la absortividad depende de la longitud de onda empleada, a menudo se indica esta como un subíndice y la unidad de longitud. Así por ejemplo, si la medida se hace a λ = 530 nm, la ecuación de Beer quedaría:
Medida de la absorbancia La espectrofotometría implica la medida de la fracción de radiación electromagnética de una longitud de onda determinada que atraviesa una disolución que contiene la muestra a analizar. Con esta finalidad se han diseñado diferentes instrumentos que genéricamente reciben el nombre de espectrofotómetros. La mayoría de los espectrofotómetros constan de una serie de componentes básicos:
Fuente de radiación adecuada a la región del espectro electromagnético empleada. Selector de longitud de onda. Cubetas o celdas para contener la muestra. Un detector de radiación que convierta la energía radiante en una señal eléctrica medible. Un procesador de la señal que permita la lectura de la señal eléctrica procedente del detector.
alt=Esquema espectrofotómetro|miniaturadeimagen|455x455px|Esquema básico de un espectrofotómetro de absorción La fuente de radiación, generalmente es una fuente de emisión continua, es decir emite la energía radiante de manera ininterrumpida en un amplio intervalo de longitudes de onda, aunque en algunas aplicaciones muy concretas y específicas se utilizan fuentes de emisión en líneas discretas, como láseres. Puesto que la absorción de los fotones se produce a una longitud determinada, es preciso dirigir el haz de radiación hacia un selector de longitud de onda, que bien, mediante un sistema de filtros elimine la mayor parte de las longitudes de onda no seseadas o bien, mediante un monocromador (prisma óptico o red de difracción) seleccione una banda estrecha de longitudes de onda lo más próxima posible a la longitud de onda analítica; es decir, la que se absorbe preferentemente. Esta luz monocromática atraviesa una muestra líquida que se encuentra contenida en el interior de una celda de media, habitualmente denominada cubeta de muestra. Tras atravesar la muestra, el haz de radiación parcialmente absorbido es dirigido hacia el detector, que es un dispositivo capaz de convertir la radiación electromagnética incidente en una pequeña corriente eléctrica, de mayor intensidad cuanto mayor es la cantidad de fotones que llegan al detector. Esta señal eléctrica es debidamente procesada para que pueda ser medida y mediante los dispositivos adecuados, poder ser leída en magnitudes de absorbancia o de transmitancia.
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