Para os satélites espaciais pequenos ver satélite artificial.

En bioloxía molecular e xenética os microsatélites do ADN, tamén chamados repeticións de secuencia simple (SSR, simple sequence repeats) ou repeticións en tándem curtas (STR, short tandem repeats), son secuencias repetidas de entre 2 e 6 pares de bases de lonxitude que se encontran no ADN. É un tipo de repeticións en tándem de número variable (VNTR), as cales poden ter distintos tamaños; neste caso son as de tamaño curto. Os microsatélites non presentan dominancia. Utilízanse como marcadores moleculares na análise de STR, que se usa para estudos forenses, de parentesco ou de poboación. Tamén se poden utilizar para estudos de duplicación xénica ou delecións, selección asistida por marcador, e pegada xenética.

Introdución Un exemplo común de microsatélite é unha repetición (CA)n, na cal n varía nos distintos alelos. Estes marcadores adoitan presentar altos niveis de polimorfismo intra e interespecífico, especialmente cando o número de repeticións é de 10 ou máis. A secuencia repetida é normalmente simple, e consta xeralmente de dous, tres ou catro nucleótidos (repeticións de di-, tri-, e tetranucleótido, respectivamente), e a secuencia pode estar repetida de 3 a 100 veces, e os loci máis grandes teñen xeralmente máis alelos debido ao maior potencial de esvaramento ou slippage (véxase máis abaixo).http://www.genetics.org/content/164/2/781.full As repetición do dinucleótido CA son moi frecuentes no xenoma humano e no doutros organismos, e están presentes cada poucos miles de pares de bases. Como adoita haber moitos alelos para un locus microsatélite, os xenotipos dunha árbore xenealóxica son xeralmente moi informativos, e normalmente pode identificarse o proxenitor dun alelo particular. Deste modo, os microsatélites son ideais para determinar a paternidade, estudos de xenética de poboacións e mapado de recombinación. É tamén o único marcador molecular que dá pistas sobre que alelos están máis estreitamente relacionados. Os microsatélites son tamén preditores da densidade de SNP, xa que as rexións de miles de nucleótidos de lonxitude que flanquean os microsatélites teñen unha densidade incrementada ou diminuída de SNPs dependendo da secuencia do microsatélite.

A variabilidade de microsatélites débese a unha maior taxa de mutación comparada coa doutras rexións neutras do ADN. Estas altas taxas de mutación poden explicarse na maior parte dos casos por apareamento incorrecto por esvaramento de febra (slippage) durante a replicación do ADN nunha soa febra do ADN. A mutación pode tamén ocorrer durante a recombinación xenética meiótica, aínda que as distribucións xenómicas de microsatélites están asociadas con sitios de recombinación máis probablemente como resultado da implicación de secuencias repetitivas na recombinación e non como consecuencia dela. Algúns erros de slippage son rectificados polos mecanismos de corrección de probas no núcleo celular, pero algunhas mutacións poden escapar á reparación. O tamaño da unidade de repetición, o número de repeticións e a presenza de repeticións variantes son factores importantes, xunto coa frecuencia de transcrición na área da repetición do ADN. A interrupción dos microsatélites, quizais debido a mutación, pode orixinar un polimorfismo reducido. Porén, este mesmo mecanismo pode levar ocasionalmente a unha amplificación incorrecta de microsatélites; se o slippage ocorre ao inicio ou durante a PCR, poden amplificarse microsatélites de lonxitudes incorrectas.

Análise de microsatélites

Amplificación Os microsatélites poden ser amplificados para a súa identificación pola reacción en cadea da polimerase (PCR), utilizando as secuencias únicas das rexións flanqueantes como cebadores. O ADN é desnaturalizado repetidamente a altas temperaturas para separar as febras da dobre hélice do ADN, despois arrefríase para permitir o annealing dos cebadores e a extensión de secuencias de nucleótidos a través do microsatélite. Este proceso dá lugar á produción de suficiente ADN como para que sexa visible en electroforese en xel de agarosa ou de poliacrilamida; para facer a amplificación só cómpren pequenas cantidades iniciais de ADN porque deste modo o termociclado produce un incremento exponencial do segmento replicado. Co desenvolvemento da tecnoloxía da PCR, os cebadores que flanquean os loci microsatélites son rápidos e simples de usar, pero o desenvolvemento de cebadores que funcionen correctamente é a miúdo un proceso custoso e tedioso. miniatura|dereita|Varias mostras de ADN de espécimes do molusco Littorina plena amplificados usando cebadores de PCR dirixidos a un locus dunha repetición de secuencia simple variable (SSR, ou microsatélite). As mostras fixéronse correr en xel de poliacrilamida ao 5% e foron visualizadas utilizando tinguidura de prata.

Creación de cebadores de microsatélites Cando se está a procurar marcadores microsatélites situados en rexións específicas do xenoma, por exemplo dentro dun determinado exón dun xene, os cebadores poden ser designados manualmente. Isto implica examinar a secuencia do ADN xenómico na procura de repeticións microsatélite, o cal pode facerse tamén con ferramentas automatizadas como repeat masker. Unha vez que se determinaron os microsatélites potencialmente útiles (eliminando os que non son útiles como os que teñen insercións aleatorias dentro da rexión repetida), as secuencias flanqueantes poden utilizarse para deseñar cebadores oligonucleótidos que servirán para amplificar a repetición microsatélite específica nunha reacción de PCR.

Os cebadores microsatélites aleatorios poden desenvolverse clonando segmentos de ADN aleatorios a partir da especie focal. Estes segmentos aleatorios son inseridos nun vector de clonación de tipo plásmido ou bacteriófago, o cal á súa vez é implantado na bacteria Escherichia coli. Cultívanse as colonias, e son examinadas con secuencias de oligonucleótidos etiquetadas fluorescentemente que se hibridarán a unha repetición microsatélite, se está presente no segmento de ADN. Se se obteñen clons positivos, secuénciase o ADN e elíxense os cebadores de PCR a partir das secuencias que flanquean ditas rexións para determinar un locus específico. Este proceso implica un significativo ensaio e erro por parte dos investigadores, xa que deben predicirse as secuencias repetidas microsatélite, e os cebadores que foron illados aleatoriamente poden non presentar un polimorfismo significativo. Os loci microsatélite están amplamente distribuídos polo xenoma e poden illarse a partir do ADN semidegradado de espécimes máis vellos, xa que todo o que se precisa é un substrato axeitado para a amplificación por medio da PCR.

Outras técnicas máis recentes implican o uso de secuencias de oligonucleótidos que constan de repeticións que son complementarias das repeticións no microsatélite para "enriquecer" o ADN extraído (enriquecemento de microsatélite). A sonda oligonucleotídica hibrida coa repetición do microsatélite, e despois o complexo sonda/microsatélite é sacado da solución. O ADN enriquecido é despois clonado como é normal, pero a proporción de éxito será agora moito maior, reducindo drasticamente o tempo requirido para desenvolver as rexións para o seu uso. Porén, decidir as sondas que se usarán pode ser un proceso de ensaio e erro.

ISSR-PCR ISSR ou inter-repeticións de secuencias simples (inter-simple sequence repeats) é un termo que se utiliza para referirse a unha rexión do xenoma situada entre loci microsatélites. As secuencias complementarias de dous microsatélites veciños utilízanse como cebadores de PCR; amplifícase a rexión variable entre eles. A duración limitada dos ciclos de amplificación durante a PCR impide unha excesiva replicación de secuencias excesivamente próximas de ADN, polo que o resultado será unha mestura dunha variedade de febras de ADN amplificadas, as cales son xeralmente curtas, pero poden variar moito en lonxitude.

As secuencias amplificadas por ISSR-PCR poden utilizarse para obter a pegada xenética. Como unha ISSR pode ser unha rexión conservada ou non conservada, esta técnica non é útil para distinguir individuos, senón principalmente para análises filoxeográficas ou de delimitación de especies; a diversidade de secuencia é menor que na SSR-PCR, pero é maior que en secuencias xénicas reais. Ademais, a secuenciación de microsatélites e a secuenciación ISSR axúdanse mutuamente, xa que unha produce os cebadores para a outra.

Contido Microsatélite Global con micromatrices Usando unha matriz (array) de estilo CGH fabricada por Nimblgen/Roche pode medirse rapidamente o contido completo de microsatélites dun xenoma, de forma barata e en masa. É importante salientar que este enfoque non avalía o xenotipo dun locus calquera determinado, senón que suma as contribucións para un motivo repetido dado de moitas posicións nas que está presente ese motivo en todo o xenoma. Esta matriz avalía todas as repeticións de 1 a 6 mer (e as súas permutacións cíclicas e complementos). Este enfoque foi utilizado para situar calquera especie, secuenciada ou non, nunha árbore taxonómica. Esa árbore correspóndese de forma precisa coas relacións filoxeneticas actualmente aceptadas. Con esta nova plataforma tecnolóxica é posible estudar as variacións xenómicas nun individuo naquelas características xenómicas que son máis variables, os microsatélites.

Os estudos que utilizan matrices de contido microsatélite global indican que hai importantes novos mecanismos de desestabilización xenómicos que modifican globalmente os microsatélites, alterando así potencialmente un número moi grande de xenes. Estas variacións a escala global en mostras de pacientes tumorais e da liña xerminal poden exercer importantes papeis no proceso do cancro, potencialmente valiosos na diagnose, prognose e terapia.

Limitacións

Os microsatélites son marcadores moleculares versátiles, particularmente para análise de poboacións, pero teñen tamén limitacións. Os microsatélites desenvolvidos para especies particulares poden a miúdo aplicarse a especies moi relacionadas, pero a porcentaxe de loci que amplifican con éxito pode decrecer cando se incrementa a distancia xenética. As mutacións puntuais no sitio de annealing do cebador en ditas especies poden facer que aparezan "alelos nulos" nos puntos onde os microsatélites non se poden amplificar nos ensaios de PCR. Os alelos nulos poden atribuírse a varios fenómenos. A diverxencia de secuencia en rexións flanqueantes pode orixinar un aliñamento do cebador deficiente, especialmente na sección 3', onde comeza a extensión; a amplificación preferencial de alelos de determinados tamaños debido á natureza competitiva da PCR que pode facer que individuos heterocigotos sexan contabilizados como homocigotos (nulo parcial). Os fallos na PCR poden producirse cando falla a amplificación de loci particulares, mentres que outros se amplifican máis eficientemente e poden parecer homocigotos nun ensaio en xel, cando en realidade son heterocigotos no xenoma. Os alelos nulos complican a interpretación das frecuencias de alelos microsatélites e provocan que se fagan estimacións erradas do parentesco. Ademais, os efectos estocásticos da mostraxe que se producen durante o apareamento poden cambiar as frecuencias alélicas dun modo que é moi similar ao efecto dos alelos nulos: unha frecuencia excesiva de homocigotos que causa desviacións do equilibrio de Hardy-Weinberg esperado. Como os alelos nulos son un problema técnico e os efectos de mostraxe que ocorren durante o apareamento son unha propiedade biolóxica real dunha poboación, é con frecuencia moi importante distinguir entre eles se se observa un exceso de homocigotos.