A proteína de reparación de escisións do ADN ERCC1 é unha proteína que nos humanos está codificada no xene ERCC1 do cromosoma 19. Xunto con ERCC4 (tamén chamada XPF), a proteína ERCC1 forma o complexo encimático ERCC1-XPF, que participa na reparación e recombinación do ADN.
Moitos aspectos destes dous produtos xénicos son descritos conxuntamente aquí porque actúan xuntos durante a reparación do ADN. A actividade nuclease de ERCC1-XPF é esencial na vía da reparación por escisión de nucleótidos (NER) do ADN. A nuclease ERCC1-XPF tamén funciona na vía de reparación de roturas de dobre febra no ADN, e na reparación de danos por “enlaces cruzados” que ligan de forma nociva as dúas febras do ADN.
As células que teñen mutacións que incapacitan o xene ERCC1 son máis sensibles do normal a determinados axentes que causan danos ao ADN, como os raios ultravioletas (UV) e compostos químicos que causan enlaces cruzados entre as febras de ADN. Os ratos alterados por enxeñaría xenética con mutacións que anulan o xene ERCC1 teñen defectos na reparación do ADN, acompañados por cambios inducidos polo estrés metabólico na súa fisioloxía, que teñen como resultado un envellecemento prematuro. A deleción completa de ERCC1 é incompatible coa viabilidade dos ratos, e non se encontrou ningunha persoa cunha deleción completa (homocigota) de ERCC1. En raros casos algunhas persoas nunha poboación humana presentan mutacións herdadas que incapacitan o funcionamento de ERCC1. Cando os xenes normais están ausentes, estas mutacións poden orixinar síndromes humanas, incluíndo a síndrome de Cockayne e a síndrome cerebro-oculo-facial-esquelética.
ERCC1 e ERCC4 son os nomes destes xenes asignados aos xenomas de mamíferos, como o xenoma humano. Xenes similares con funcións semellantes encóntranse en todos os organismos eucariotas.
Xene
O ADN xenómico para ERCC1 foi o primeiro xene de reparación do ADN humano en ser illado por clonación molecular. O método orixinal foi por transferencia de fragmentos do xenoma humano a liñas celulares mutantes sensibles á luz ultravioleta (UV) derivadas de células de ovario de hámster chinés. Referíndose a este método de complementación xenética entre especies, o xene foi chamado en inglés “Excision repair cross-complementing 1”, de onde veñen as siglas ERCC1. Illáronse múltiples grupos de complementación independentes de células de ovario de hámster chinés (CHO), e este xene restaurou a resistencia a radiación UV para as células do grupo de complementación 1.
O xene ERCC1 humano codifica a proteína ERCC1 de 297 aminoácidos cunha masa molecular duns 32 500 daltons.
Xenes similares a ERCC1 con funcións equivalentes (ortólogos) encóntranse noutros xenomas eucariotas. Algúns dos xenes ortólogos máis estudados son o RAD10 do lévedo de xemación Saccharomyces cerevisiae e o swi10+ do lévedo de fisión Schizosaccharomyces pombe.
Proteína miniatura|esquerda|Diagrama da ERCC1 que mostra un dominio central e un dominio hélice-forquita-hélice
Unha molécula de ERCC1 únese a unha molécula de XPF, formando un heterodímero ERCC1-XPF, que é a forma de nuclease activa do encima. No heterodímero ERCC1–XPF, ERCC1 media as interaccións co ADN e proteína-proteína. O XPF proporciona o sitio activo da endonuclease e está implicado na unión do ADN e interaccións proteína-proteína adicionais.
A proteína ERCC4/XPF consta de dous dominios conservados separados por unha rexión menos conservada en medio. A rexión N-terminal ten homoloxía con varios dominios conservados de ADN helicases que pertencen á superfamilia II, aínda que XPF non é unha ADN helicase. A rexión C-terminal de XPF inclúe os residuos do sitio activo para a actividade de nuclease. A maior parte da proteína ERCC1 está relacionada a nivel de secuencia co C-terminal da proteína XPF, pero carece dos residuos do dominio nuclease. hai un dominio “hélice-forquita-hélice” de unión ao ADN no extremo C-terminal de cada proteína.
Pola súa secuencia primaria e semellanza estrutural, a nuclease ERCC1-XPF é un membro dunha ampla familia de ADN nucleases específicas de estrutura que comprenden dúas subunidades. Entre esas nucleases está, por exemplo, a nuclease MUS81-EME1.
Nuclease específica de estrutura miniatura|Substratos de ADN da nuclease ERCC1-XPF
O complexo ERCC1–XPF é unha endonuclease específica de estrutura. O ERCC1-XPF só corta o esqueleto fosfodiéster do ADN especificamente nas unións entre o ADN de dobre febra e de febra simple. Introduce un corte no ADN de dobre febra no lado 5′ desa unión, a uns dous nucleótidos de distancia. Esta especificidade de estrutura foi inicialmente demostrada para RAD10-RAD1, os ortólogos nos lévedos de ERCC1 e XPF.
Os motivos hidrófobos hélice–forquita–hélice nas rexións C-terminais de ERCC1 e XPF interaccionan promocionando a dimerización das dúas proteínas. Non hai actividade catalítica en ausencia de dimerización. Aínda que o dominio catalítico está incluído en XPF, e ERCC1 é cataliticamente inactivo, o ERCC1 é indispensable para a actividade do complexo.
Propuxéronse varios modelos para explicar a unión de ERCC1–XPF ao DNA, baseados en estruturas parciais de fragmentos de proteínas relevantes a resolución atómica. A unión ao ADN mediada polos dominios hélice-forquita-hélice de ERCC1 e dominios XPF sitúa o heterodímero nas zonas de unión entre o ADN de dobre febra e de febra simple.
Reparación por escisión de nucleótidos
Durante a reparación por escisión de nucleótidos, varios complexos proteicos cooperan para recoñecer o ADN danado e separan localmente a hélice do ADN durante unha curta distancia a ambos os lados do sitio do dano no ADN. A nuclease ERCC1–XPF fai unha incisión na febra de ADN danado no lado 5′ da lesión. Durante a reparación por escisión de nucleótidos, a proteína ERCC1 interacciona coa proteína XPA para coordinar a unión entre o ADN e a proteína.
Reparación de roturas de dobre febra
As células de mamíferos con ERCC1–XPF mutantes son moderadamente máis sensibles que as células normais a axentes (como as radiacións ionizantes) que causan roturas de dobre febra no ADN. As vías particulares da reparación por recombinación homóloga e por unión de extremos non homólogos dependen da función de ERCC1-XPF. A actividade relevante de ERCC1–XPF para ambos os tipos de reparación de roturas de dobre febra é a súa capacidade de eliminar as colas de febra simple 3' non homólogas dos extremos do ADN antes de volver unilas. Esta actividade é necesaria durante unha subvía de annealing de febra simple da recombinación homóloga. O podado da cola de febra simple 3' é tamén necesaria nunha subvía con mecanismo distinto de unión de extremos non homólogos, dependente das proteínas Ku. A integración homóloga do ADN, unha importante técnica para a manipulación xenética, é dependente da función de ERCC1-XPF na célula hóspede.
Reparación de enlaces cruzados entre febras do ADN
As células de mamíferos que portan mutacións en ERCC1 ou XPF son sensibles especificamente a axentes que causan a formación de enlaces cruzados entre as febras do ADN. Os enlaces cruzados entre febras do ADN bloquean a progresión da replicación do ADN, e as estruturas que quedan bloqueadas nas forcadas de replicación do ADN proporcionan substratos para a clivaxe feita por ERCC1-XPF. As incisións poden facerse a ambos os lados dos enlaces cruzados nunha febra de ADN para desfacer os enlaces cruzados e iniciar a reparación. Alternativamente, pode facerse unha rotura de dobre febra no ADN preto de enlaces cruzados entre febras, e a subseguinte reparación de recombinación homóloga pode implicar a acción da ERCC1-XPF. Aínda que non é a única nuclease implicada, o ERCC1–XPF é necesario para a reparación de enlaces cruzados entre febras durante varias fases do ciclo celular.
Importancia clínica
Síndrome cerebro-oculo-facial-esquelética
Hai uns poucos casos de pacientes con mutacións de ERCC1 gravemente incapacitantes que causan a síndrome cerebro-oculo-facial-esquelética (COFS). Esta síndrome é un trastorno recesivo raro no cal os individuos afectados sofren un declive neurolóxico rápido e indicios de envellecemento acelerado. Un caso moi grave de tales mutacións incapacitantes é a mutación F231L no dominio hélice-forquita-hélice en tándem de ERCC1 na súa interface con XPF. Esta mutación é moi importante para a estabilidade do complexo ERCC1-XPF. Un residuo de fenilalanina axuda a ERCC1 a acomodar un residuo clave de fenilalanina do XPF (F894) e a mutación (F231L) altera esta función de acomodación. Como consecuencia, F894 fai protrusión cara a fóra da interface e o complexo mutante é disociado máis rápido en comparación co complexo nativo. A duración da vida dos pacientes con tales mutacións adoita ser de entre 1 e 2 anos.
Síndrome de Cockayne
Un paciente de síndrome de Cockayne de tipo II designado CS20LO mostraba unha mutación homocigótica no exón 7 de ERCC1, producindo unha mutación F231L.
Relevancia en quimioterapia
Medir a actividade de ERCC1 pode ser útil en medicina do cancro clínica porque un mecanismo de resistencia a fármacos quimoterápicos de platino correlaciónase coa alta actividade de ERCC1. A reparación por escisión de nucleótidos é o mecanismo de reparación do ADN primario que elimina os adutos platino-ADN terapéuticos do ADN do tumor. Os niveis de actividade de ERCC1, ao seren unha parte importante da vía final común da reparación por escisión de nucleótidos, poden servir como un marcador do rendemento xeral da reparación por escisión de nucleótidos. Isto foi suxerido para pacientes con cancros gástricos, ováricos, colorrectais e de vexiga. No carcinoma pulmonar de células non pequenas, na extirpación cirúrxica dos tumores que non recibían ningunha terapia posterior, observouse unha mellor supervivencia se son ERCC1 positivos que se son ERCC1 negativos. Así, ser positivo para ERCC1 é un marcador de prognóstico favorable, referíndose a como avanzará a doenza se non recibe máis tratamento. Este tipo de tumores pulmonares ERCC1 positivos non se benefician dunha quimioterapia con plantino adxuvante. Porén, estes tumores pulmonares ERCC1 negativos, que son peores no seu prognóstico sen tratamento, obteñen un beneficio substancial do uso de quimioterapia con cisplatino adxuvante. Un alto ERCC1 é así un marcador preditivo negativo, referíndose a como responderá a un tipo específico de tratamento.
O xenotipado de ERCC1 en humanos mostrou un polimorfismo significativo no codón 118. Estes polimorfismos poden ter efectos diferenciais nos danos causados polo platino e mitomicina.
Deficiencia no cancro
A expresión da proteína ERCC1 está reducida ou ausente no 84% ao 100% dos cancros colorrectais, e o promotor de ERCC1 está metilado no 38% dos gliomas, o que ten como resultado unha redución da síntese de ARNm e da expresión das proteínas. O promotor de ERCC1 foi localizado no ADN 5 quilobases augas arriba da rexión codificante da proteína. As frecuencias das reducións epixenéticas doutros nove xenes de reparación do ADN foron avaliadas en varios cancros e ían desde o 2% (OGG1 no cancro de tiroide papilar) ao 88% e 90% (MGMT en cancros gástricos e de colon, respectivamente). Así, a redución da expresión da proteína ERCC1 no 84% ao 100% dos cancros de colon indica que a redución de ERCC1 é unha das reducións máis frecuentes de xenes de reparación do ADN observadas no cancro. A deficiencia na expresión da proteína ERCC1 parece ser un evento temperán na carcinoxénese de colon, xa que ERCC1 é deficiente no 40% das criptas a 10 cm a cada lado da zona do adenocarcinoma de colon (dentro dos defectos de campo temperáns a partir dos cales probablemente se orixinan os cancros).