En biotecnoloxía, a citometría de fluxo é unha tecnoloxía biofísica baseada na impedancia eléctrica e no láser empregada para a contaxe de células, selección de células, detección de biomarcadores e enxeñaría de proteínas, na que se suspenden as células nunha corrente dun fluído e fanse pasar por un aparello electrónico de detección. Un citómetro de fluxo permite a análise multiparamétrica simultánea das características físicas ou químicas de ata miles de partículas (células, proteínas...) por segundo.
A citometría de fluxo utilízase rutineiramente no diagnóstico de trastornos da saúde, especialmente cancros hematolóxicos, pero ten moitas outras aplicacións en investigación básica, práctica clínica e probas clínicas. Unha variante común desta técnica implica ligar a capacidade analítica do citómetro de fluxo a un aparello para escoller as partículas, para así separalas fisicamente e, por tanto, purificar as partículas de interese baseándose nas súas propiedades ópticas. Tales procesos denomínanse selección ou clasificación de células, e o instrumento adoita denominarse "selector de células".
Historia
O primeiro aparello de citometría de fluxo baseado na impedancia, que usaba o principio de Coulter, foi patentado nos Estados Unidos en 1953 por Wallace H. Coulter. Mack Fulwyler foi o inventor do predecesor dos citómetros de fluxo de hoxe en día, especialmente o selector de células.US 3380584 , Mack Fulwyler, "Particle Separator", issued 1965-06-01 Fulwyler desenvolveu isto en 1965 coa súa publicación na revista Science. O primeiro citómetro de fluxo baseado en fluorescencia (ICP 11) foi desenvolvido en 1968 por Wolfgang Göhde na Universidade de Münster, patentado ese mefsmo anoDE 1815352 , Wolfgang Dittrich & Wolfgang Göhde, "Flow-through Chamber for Photometers to Measure and Count Particles in a Dispersion Medium" e comezado a comercializar en 1968/69 polo desenvolvedor alemán e fabricante Partec a través de Phywe AG en Göttingen. Nesa época, os métodos de absorción eran aínda os preferidos por outros científicos en vez dos métodos de fluorescencia.Kamentsky in Proceedings of the 1968 Conference „Cytology Automation" (1970), edited by D. M. D. Evans. Pouco despois, desenvolvéronse instrumentos para a citometría de fluxo, incluíndo o citofluorógrafo (1971) de Bio/Physics Systems Inc. (posteriormente chamada Ortho Diagnostics), o PAS 8000 (1973) de Partec, o primeiro FACS (fluorescence-activated cell sorting ou selector de células activado por fluorescencia) de Becton Dickinson (1974), o ICP 22 (1975) de Partec/Phywe e o Epics de Coulter (1977/78). O primeiro citómetro de fluxo de impedancia de alta frecuencia sen necesidade de etiquetaxe baseado nun "lab-on-chip" microfluídico patentado, Ampha Z30, foi introducido por Amphasys (2012).
Nome
O nome orixinal da tecnoloxía de fluxo baseada na fluorescencia foi "citofotometría de pulsos" (en alemán: Impulszytophotometrie), segundo a primeira patente dunha aplicación da citometría de fluxo baseada na fluorescencia. Na 5ª Conferencia da Fundación de Enxeñaría Americana sobre Citoloxía Automatizada celebrada en Pensacola (Florida) en 1976 , oito anos despois da introdución do primeiro citometro de fluxo baseado en fluorescencia (1968), acordouse usar comunmente o nome "citometría de fluxo", un termo que rapidamente se fixo popular entre os científicos.
Principios miniatura|300px|Esquema da disposición de elementos nun citómetro de fluxo. Unha fonte emisora de luz monocromática, usualmente un feixe de luz láser (A) envía un raio que é colimado (L1) e enfocado (L2) por medio de lentes sobre a cámara de fluxo laminar (C), logo de atravesar a cámara o raio de luz directa é detido por unha pantalla (s), mentres que a luz dispersada é enfocada por outra lente (L3) sobre un fotodíodo (D1), isto constitúe o detector de dispersión frontal (FSC). A luz dispersada lateralmente e a fluorescencia enfócanse por medio dunha lente sobre un espello dicroico (M) que reflicte a maior parte da luz de igual lonxitude de onda á producida pola fonte (A), atravesa un filtro (F1) e incide sobre un detector. Isto constitúe o sistema de detección de dispersión lateral (SSC). A luz que non se reflicte polo espello dicroico, xa que ten unha lonxitude de onda diferente á emitida, atravésao e incide sobre un filtro interferencial (F2) que pode ser axustado para unha determinada lonxitude de onda, discriminando así entre diferentes fluoróforos, para finalmente incidir sobre un tubo fotomultiplicador (D3), isto constitúe o detector lateral de fluorescencia (SFL).
Un raio de luz monocromático, usualmente de luz láser, é dirixido cara a un finísimo chorro de líquido enfocado hidrodinamicamente. Colócanse unha serie de detectores no punto no que o chorro de líquido atravesa o raio de luz. Un colócase en liña co raio de luz (a este detector chámaselle FSC, por Forward Scatter ou detector de dispersión frontal), e varios angularmente á traxectoria do raio (a estes chámaselles SSC, por Side Scatter, ou detectores de dispersión lateral); ademais dun ou máis detectores de fluorescencia. Cada unha das partículas suspendidas cun tamaño de entre 0,2 a 0,150 micrómetros que atravesan o raio de luz e dispérsano, e as substancias químicas fluorescentes que se encontran dentro ou adheridas ás partículas son excitadas ata emitir luz dunha lonxitude de onda maior que a da fonte de luz. Esta combinación de luz dispersada e fluorescencia é recollida polos detectores, e por medio dunha análise da flutuación da intensidade luminosa recollida por cada detector, é posible derivar varios tipos de información sobre a estrutura física e química de cada partícula individual.
O detector frontal ou FSC dá información sobre o volume da partícula, mentres que os detectores laterais ou SSC dan información sobre a complexidade interna da mesma (por exemplo a forma do núcleo celular, a cantidade e tipo de gránulos citoplasmáticos ou a rugosidade da membrana plasmática). Isto débese a que os compoñentes internos das células dispersan a luz. Algúns dos citómetros de fluxo presentes no mercado eliminaron a necesidade dun detector de fluorescencia e utilizan só a información de luz dispersada para as medicións. Outros citómetros de fluxo poden xerar gráficos dos datos obtidos da fluorescencia das células, luz dispersada e luz transmitida.
Citómetros de fluxo miniatura|250px|Vista frontal dun citómetro de fluxo, o selector de células activado por fluorescencia Becton-Dickinson (FACSCalibur)
Os modernos citómetros de fluxo poden analizar moitos miles de partículas por segundo, en "tempo real," e, se é configurado como selector de células, pode separar activamente e illar partículas a taxas similares coas propiedades ópticas especificadas. Un citómetro de fluxo é similar a un microscopio, excepto en que en vez de producir unha imaxe da célula, o citómetro de fluxo ofrece unha cuantificación automatizada a grande escala e de alto rendemento dos parámetros ópticos especificados e célula por célula. Para analizar tecidos sólidos, debe prepararse primeiro unha suspensión de células sinxelas.
Un citómetro de fluxo ten cinco compoñentes principais: unha cela de fluxo, un sistema de medición, un detector, un sistema de amplificación e un computador para a análise de sinais. A célula de fluxo ten unha corrente de líquido (fluído envolvente), que transporta e aliña as células para que pasen en fila unha por unha a través do raios de luz para seren detectadas. O sistema de medición xeralmente usa medidas de impedancia (ou condutividade) e sistemas ópticos, como lámpadas (de mercurio ou xenon); láseres arrefriados con auga de alta potencia (de láser de argon, de cripton, láser de tinguidura); láseres arrefriados con aire de baixa potencia (argon (488 nm), vermello-HeNe (633 nm), verde-HeNe, HeCd (UV)); láseres de díodo (azul, verde, vermello, violeta) que orixinan sinais de luz. O detector e o sistema de conversión analóxica a dixital (ADC) converten as medicións analóxicas de luz dispersada fontalmente (FSC, do inglés forward-scattered ligth) e a luz dispersada lateralmente (SSC, do inglés side-scattered light) así como os sinais de fluorescencia específicos de tinguidura en sinais dixitais, que poden ser procesados por un computador. O sistema de amplificación pode ser linear ou logarítmico.
O proceso de recollida de datos a partir de mostras usando o citómetro de fluxo denomínase 'adquisición'. A adquisición realízase por medio dun computador conectado fisicamente ao citómetro de fluxo, e o software que manexa a interface dixital co citómetro. O software pode axustar parámetros (por exemplo, voltaxe, compensación) para que se poida examinar a mostra, e tamén axuda a mostrar información da mostra inicial mentres adquire os datos da mostra para asegurar que os parámetros se establecen correctamente. Os primeiros citómetros de fluxo eran, en xeral, aparellos experimentais, pero os avancces tecnolóxicos permiten amplas aplicacións para o seu uso en diversas tarefas de investigación ou clínicas. Debido a estes desenvolvementos, desenvolveuse un considerable mercado de instrumentos, software de análise,e de reactivos usados para a adquisición, como os anticorpos etiquetados fluorescentemente.
Os instrumentos modernos xeralmente teñen múltiples láseres e detectores de fluorescencia. O instrumento comercial con máis láseres e detectores ten dez láseres e 30 detectores de fluorescencia. Incrementar o número de láseres e detectores permite a etiquetaxe de moitos anticorpos, e pode identificar máis precisamente unha poboación diana polos seus marcadores fenotípicos. Certos instrumentos poden incluso tomar imaxes dixitais de células individuais, o que posibilita a análise da localización do sinal fluorescente dentro ou na superficie das células.
Análise de datos Compensación
Os fluorocromos teñen un amplo espectro de fluorescencia. Cando se usa máis dun fluorocromo, poden producirse solapamentos entre os espectros dos fluorocromos. Esta situación denomínase solapamento de espectro e debe ser evitada. Por exemplo, no espectro de emisión de FITC (fluoresceína isotiocianato) e PE (R-ficoeritrina) a luz emitida pola fluoresceína solápase na mesma lonxitude de onda a medida que pasa a través do filtro usado para PE. Este solapamento espectral é corrixido eliminando unha parte do sinal da FITC do sinal da PE ou viceversa. Este proceso denomínase compensación de cor, que calcula un fluorocromo como unha porcentaxe para medilo.
"A compensación é o proceso matemático polo cal corriximos os datos de fluxo citométrico multiparámetros para o solapamento espectral. Este solapamento, ou “spillover" ("excedente, rebordamento”), é resultado do uso de tinguiduras fluorescentes que son medibles en máis dun detector; este spillover está correlacionado por unha constante coñecida como coeficiente de spillover. O proceso de compensación é unha aplicación simple da álxebra linear, co obxectivo de corrixir os spillovers de todas as tinguiduras nos detectores, tal que no resultado os datos están efectivamente normalizados para que cada parámetro conteña información dunha soa tinguidura. En xeral, a nosa capacidade de procesar datos é máis efectiva cando a visualización de datos se presenta sen correlacións innecesarias".
En xeral, cando se mostran os gráficos dun ou máis parámetros é para mostrar que os outros parámetros non contribúen á distribución presentada. Ata agora non se descubriu ningunha ferramenta para mostrar eficientemente parámetros multidimensionais. A compensación é moi importante para ver a distinción entre células. miniatura|300px|right|Análise dunha mostra mariña de picoplancto fotosintético por citometría de fluxo que mostra tres poboacións diferentes (Prochlorococcus, Synechococcus e picoeucariotas)
Gating