O northwestern blot, tamén chamado ensaio northwestern, é unha técnica analítica de bioloxía molecular híbrida entre o western blot e o northern blot, que se utiliza para detectar as interaccións entre o ARN e as proteínas. A técnica relacionada do western blot utilízase para detectar proteínas de interese realizando unha transferencia a unha membrana de nitrocelulosa de ditas proteínas, que son separadas previamente por electroforese en xel. Os grupos de precipitados coloreados ao longo das bandas que quedan sobre a membrana conteñen unha determinada proteína diana. O northern blot é unha técnica similar que, en vez de detectar unha proteína de interese, úsase para estudar a expresión xénica pola detección de ARN (ou ARNm illado) sobre unha membrana similar á do western blot. Pola súa parte, o northwestern blot combina as dúas técnicas, e implica especificamente a identificación de ARN etiquetado que interacciona con proteínas que son inmobilizadas nunha membrana de nitrocelulosa similar. Serve para separar proteínas que interaccionan co ARN.
Historia
O científico Edwin Southern foi o creador da primeira técnica de blotting ou transferencia, que se denominou co seu apelido Southern blot (transferencia de Southern), que era unha técnica analítica utilizada para detectar ADN. A técnica requiría usar electroforese en xel, un importante método analítico que implica a migración de ADN, ARN ou proteínas cargados a través dun campo eléctrico, que se separan baseándose no seu tamaño e carga. No Southern blot, os fragmentos de ADN separados son despois transferidos a unha membrana de filtración para a detección. Detéctanse como bandas que se fan visibles na membrana e correlaciónanse cunha determinada molécula de interese. Posteriormente, apareceron outras técnicas de blotting que se nomearon facendo un xogo de palabras co apelido Southern e os nomes dos puntos cardinais en inglés, que servían par detectar outras moléculas ou as interaccións entre moléculas. Entre elas están o western blot (para detección de proteínas), o northern blot (detección de ARN), o southwestern blot (detección da interacción ADN-proteína), o eastern blot (detección de modificacións postraducionais) e a northwestern blot (detección de interacción ARN-proteína). Estas técnicas escríbense con frecuencia con maiúscula, facendo unha analoxía co Southern blot.Alberts, B., Johnson, A., Lewis, J. Raff, M., Roberts, K., Walter, P. 2008. Molecular Biology of the Cell, 5th ed. Garland Science, Taylor & Francis Group, NY, pp 538-539.Kevil, C. G., Walsh, L., Laroux, F. S., Kalogeris, T., Grisham, M. B., Alexander, J. S. (1997) An Improved, Rapid Northern Protocol. Biochem. and Biophys. Research Comm. 238:277-279.
Especificidades da técnica
Realizar un northwestern blot implica separar as proteínas que se unen ao ARN por medio de electroforese en xel, que as sepra bseándose no seu tamaño e carga. Cada mostra debe cargarse nos pozos dun xel de agarosa ou poliacrilamida (xeralmente para facer unha SDS-PAGE) para analizar múltiples mostras ao mesmo tempo. Unha vez que se completou a electroforese en xel, o xel e as proteínas que se unen ao ARN asociadas son transferidas a un papel ou lámina de nitrocelulosa.
Os blots acabados de transferir son despois mergullados nunha solución bloqueante; tampóns bloqueantes comúns son o leite desnatado e a seroalbumina bovina. Esta solución bloqueante axuda a impedir que se produzan unións non específicas cos anticorpos primarios ou secundarios da membrana de nitrocelulosa. Unha vez que se deixou que a solución bloqueante tivese un tempo adecuado de contacto co blot, aplícase un ARN competidor específico e déixase tempo para que incube á temperatura dunha habitación. Durante este tempo, o ARN competidor únese ás proteínas que se unen ao ARN nas mostras do blot. O tempo de incubación durante este proceso pode variar dependendo da concentración do ARN competidor aplicado, pero adoita ser dunha hora. Despois de completada a incubación, o blot adoita lavarse polo menos tres veces durante 5 minutos en cada lavado, para diluír e retirar o ARN da solución. Tampóns de lavado comúns son o salino tamponado con fosfato (PBS) ou unha solución ao 10% de Tween 20. Un lavado incorrecto afecta á claridade do revelado do blot. Unha vez rematado o lavado, o blot revélase despois con raios X ou métodos similares de autorradiografía.
Aplicacións
Despois de revelar o blot usando raios X ou autorradiografía, os resultados poden anlizarse e interpretarse para determinar o tamaño proximado e concentración das proteínas de interese que se unen o ARN para realizar un posterior estudo das mesmas. A localización e concentración das proteínas que se unen ao ARN no blot poden afectar os resultados, e por veces poden aparecer bandas despois do revelado. Estas bandas poden axudar aos investigadores a determinr o tamaño e a concentración das proteínas que se unen ao ARN de interese. Cando se coñece o tamaño aproximado da proteína, a mostra orixinal pode facerse pasar por unha máquina de cromatografía para separala por tamaño. Ademais, unha vez que se illa a proteína, pode dixerirse con tripsina, e pode utilizarse a espectrometría de masas para secuenciar os péptidos e determinar a identidade da proteína específica.
Vantaxes e desvantaxes
Entre as vantaxes que teñen os northwestern blots están a detección rápida de proteínas específicas que se unen ao ARN e a estimación dos pesos moleculares aproximados de ditas proteínas. O northwestern blot permite a detección de proteínas identificadas de forma barata. O blot é normalmente o primeiro paso que se realiza nunha investigación, xa que permite a identificación dos pesos moleculares aproximados, e unha vez que se coñece o peso molecular permite posteriores investigacións ou purificacións usando outros métodos como a cromatografía. Outra vantaxe do northwestern blot é que axuda a construír bibliotecas de expresión de ligandos cognados.
Unha desvantaxe que se ten sinalado é que algunhas interaccións ARN-proteína con propiedades de unión ao ARN malas poden non ser detectables con esta técnica. Ademais, o procedemento do blotting pode tardar de 3 a 5 horas. Se o procedemento non se fai correctamente pode causar un significativo fondo que pode orixinar un blot pouco claro das proteínas identificadas. Adicionalmente, as proteínas necesitan renaturalizrse antes de ser separadas e transferidas á membrana de nitrocelulosa. Unha última desvantaxe é que as proteínas deben constar dun só polipéptido ou de dúas subunidades que comigran na matriz do xel.
Notas
Véxase tamén Outros artigos Southern blot Western blot Northern blot Southwestern blot Eastern blot Electroforese en xel SDS-PAGE Cromatografía
Ligazóns externas Protocolos
Northwestern blot da interacción proteínas-ARN de panículas novas de arroz Illamento de ARN e análise por nortern blot Técnicas de blotting de proteínas
Categoría:Técnicas de bioloxía molecular