Un vector de expresión ou construto de expresión é xeralmente un plásmido ou un virus deseñado para a expresión xénica en células. O vector é utilizado para introducir un xene específico nunha célula diana, e pode recrutar o mecanismo da célula para a síntese de proteínas para producir a proteína codificada polo xene. Os vectores de expresión son as ferramentas básicas en biotecnoloxía para a produción de proteínas.
O vector é preparado por enxeñaría para que conteña secuencias reguladoras que actúan como rexións amplificadoras e promotoras e causen unha transcrición eficiente do xene que porta o vector de expresión.sci.sdsu.edu O obxectivo dun vector de expresión ben deseñado é a produción eficiente dunha proteína, e isto pode conseguirse pola produción de cantidades significativas de ARN mensaxeiro estable, que pode despois ser traducido a proteínas. A expresión dunha proteína pode estar estreitamente controlada, de tal xeito que a proteína só se produza en cantidades significativas cando é necesario polo uso dun indutor; porén, nalgúns sistemas a proteína pode expresarse constitutivamente. Escherichia coli é o organismo utilizado comunmente como hóspede para a produción de proteínas, mais poden utilizarse tamén outros tipos celulares. Un exemplo do uso dun vector de expresión é a produción de insulina, que se utiliza como tratamento médico da diabetes.
Elementos dos vectores de expresión
Un vector de expresión ten as características que todo vector pode ter, como unha orixe de replicación, un marcador seleccionable e un sitio axeitado o para a inserción dun xene, como o sitio de clonación múltiple. O xene clonado pode ser transferido desde un vector de clonación especializado a un vector de expresión, aínda que é posible clonar directamente nun vector de expresión. O proceso de clonación realízase normalmente en Escherichia coli, e os vectores usados para a produción de proteínas en organismos distintos de E. coli poden ter, ademais dunha orixe de replicación axeitada para a súa propagación en E. coli, elementos que lles permiten ser mantidos noutro organismo e estes vectores denomínanse vectores lanzadeira.
Elementos para a expresión
Un vector de expresión debe ter os elementos necesarios para a expresión xénica. Estes poden incluír un promotor, a correcta secuencia de iniciación da tradución como un sitio de unión ao ribosoma e o codón de iniciación, un codón de terminación e unha secuencia de terminación da transcrición. Entre procariotas e eucariotas existen diferenzas en canto á maquinaria para a síntese proteica, polo que os vectores de expresión deben ter os elementos para a expresión que sexan apropiados para o hóspede elixido. Por exemplo, os vectores de expresión en procariotas terán unha secuencia Shine-Dalgarno no seu sitio de iniciación da tradución para a unión dos ribosomas, mentres que os vectores de expresión de eucariotas conterán a secuencia consenso Kozak.
O promotor inicia a transcrición e é, por tanto, o punto de control para a expresión do xene clonado. Os promotores usados no vector de expresión son normalmente inducibles, o que significa que a síntese proteica só se inicia cando é requirida pola introdución dun indutor como o IPTG. Porén, nalgúns vectores de expresión a expresión xénica pode tamén ser constitutiva (é dicir, a proteína exprésase constitutivamente, de forma constante). Pode ocorrer unha síntese de proteínas constitutiva a baixo nivel mesmo en vectores de expresión con promotores estreitamente controlados.
Etiquetas proteicas
Despois da expresión do produto do xene, adoita ser necesario para purificar a proteína expresada; porén, separar a proteína de interese da gran maioría das proteínas da célula hóspede pode ser un proceso moi longo. Para facer que este proceso de purificación sexa máis doado, pode engadirse unha etiqueta de purificación ao xene clonado. Esta etiqueta pode ser unha etiqueta de histidina (His), outros péptidos marcadores, ou un compañeiro de fusión como a glutatión S-transferase ou a proteína de unión á maltosa. Algúns destes compañeiros de fusión poden tamén axudar a incrementar a solubilidade dalgunhas proteínas expresadas. Outras proteínas de fusión como a proteína fluorescente verde pode actuar como un xene reporteiro para a identificación de xenes clonados exitosamente.
Outros O vector de expresión é transformado ou transfectado na célula hóspede para a síntese de proteínas. Algúns vectores de expresión poden ter elementos para a transformación ou a inserción do ADN no cromosoma hóspede, por exemplo os xenes vir para a transformación de plantas e os sitios de integrase para a integración cromosómica.
Algúns vectores poden incluír unha secuencia de destino que pode destinar a proteína expresada a unha localización específica no espazo periplásmico da bacteria.
Sistemas de expresión/produción
Diferentes organismos poden utilizarse para expresar a proteína diana dun xene, e o vector de expresión utilizado terá, por tanto, elementos específicos para o uso nun determinado organismo. O organismo máis utilizado comunmente para a produción de proteínas é a bacteria Escherichia coli. Porén, non todas as proteínas poden ser expresadas debidamente en E. coli, ou ser expresadas coa forma correcta de modificacións postraducionais, como as glicosilacións, polo que poden utilizarse outros sistemas.
Bacterias
miniatura|Un exemplo dun vector de expresión bacteriano é o plásmido pGEX-3x. A elección do hóspede de expresión para a expresión de moitas proteínas é Escherichia coli, xa que a produción de proteínas heterólogas en E. coli é relativamente simple e conveniente, e tamén é rápida e barata. Disponse de moitos plásmidos de expresión de E. coli para unha ampla variedade de necesidades. Outra bacteria usada para a produción de proteínas é Bacillus subtilis.
A maioría das proteínas heterólogas exprésanse no citoplasma de E. coli. Porén, non todas as proteínas formadas poden solubilizarse no citoplasma e as proteínas pregadas incorrectamente formadas no citoplasma poden formar agregados insolubles chamados corpos de inclusión. Tales proteínas insolubles deberán volver a pregarse, o cal pode ser un proceso complicado e pode que non necesariamente produza un alto rendemento. As proteínas que teñen enlaces disulfuro non adoitan ter a capacidade de pregarse correctamente debido ao ambiente redutor que reina no citoplasma, que impide a formación de tales enlaces, e unha posible solución é destinar a proteína ao espazo periplásmico utilizando unha secuencia sinal N-terminal. Outra posibilidade é manipular o ambiente redox do citoplasma. Tamén se están desenvolvendo outros sistemas máis sofisticados; ditos sistemas poden permitir a expresión de proteínas que previamente se pensaba que era imposible en E. coli, como a das proteínas glicosiladas.
Os promotores usados para estes vectores están baseados usualmente no promotor do operón lac ou o promotor do fago T7, e están normalmente regulados polo operador lac. Estes promotores poden tamén ser híbridos de diferentes promotores, por exemplo, o promotor tac é un híbrido dos promotores trp e lac. Nótese que a maioría dos promotores lac ou derivados de lac comunmente usados están baseados no mutante lacUV5, que é insensible a represión por catabolito. Este mutante permite a expresión da proteína baixo o control do promotor lac cando o medio de crecemento contén glicosa, xa que a glicosa inhibiría a expresión xénica se se usa o tipo silvestre do promotor lac. A presenza de glicosa, non obstante, pode utilizarse para reducir a expresión de fondo por inhibición residual nalgúns sistemas.
Exemplos de vectores de expresión de E. coli son a serie de vectores pGEX, nos que se utiliza a glutatión S-transferase como compañeiro de fusión e a expresión xénica está baixo o control do promotor tac, e a serie de vectores pET, que usa un promotor T7.
É posible expresar simultaneamente dúas ou máis proteínas diferentes en E. coli usando distintos plásmidos. Porén, cando se usan dous ou máis plásmidos, cada plásmido necesita usar un antibiótico de seleción diferente e tamén unha orixe de replicación distinta, xa que doutro modo os plásmidos non se poderían manter establemente na célula. Moitos plásmidos utilizados habitualmente están baseados no replicón de ColE1 e son, por tanto, incompatibles entre si. Para que un plásmido baseado en ColE1 coexista con outro na mesma célula, o outro terá que ser dun replicón diferente, por exemplo un plásmido baseado no replicón p15A como os plásmidos da serie pACYC. Outro posible enfoque sería usar un só vector de dous cistróns ou deseñar secuencias codificantes en tándem como un construto bi- ou policistrónico.
Lévedos
Un lévedo usado frecuentemente para a produción de proteínas é Pichia pastoris. Exemplos de vector de expresión en Pichia son os vectores da serie pPIC, e estes vectores usan o promotor AOX1, que é inducible con metanol. Os plásmidos poden conter elementos para a inserción de ADN alleo no xenoma do lévedo e a secuencia sinal para a secreción da proteína expresada. En E. coli poden producirse eficientemente as proteínas con enlaces disulfuro e glicosilación. Outro lévedo usado para a produción de proteínas é Kluyveromyces lactis e o xene é expresado baixo a dirección do forte promotor dunha variante da lactase LAC4.
Saccharomyces cerevisiae é moi utilizado en estudos de expresión xénica en lévedos, como por exemplo nun sistema de dous híbridos de lévedos para o estudo das interaccións proteína-proteína. Os vectores usados no sistema de dous híbridos de lévedos conteñen compañeiros de fusión para dous xenes clonados que permiten a transcrición dun xene reporteiro cando hai unha interacción entre as dúas proteínas expresadas a partir dos xenes clonados.
Baculovirus
Os baculovirus son virus con forma de bastón que infectan células de insectos, que se utilizan como vectores de expresión nese sistema. Utilízanse como hóspede liñas de células de insectos derivadas de lepidópteros (avelaíñas e bolboretas), como Spodoptera frugiperda. Unha liña celular derivada da avelaíña Trichoplusia ni é de especial interese, xa que se desenvolveu para crecer rápido e sen o caro soro que normalmente se necesita para impulsar o crecemento celular. O vector lanzadeira denomínase bácmido, e a expresión xénica está baixo o control do forte promotor pPolh. Os baculovirus foron tamén utilizados con liñas celulares de mamíferos no sistema BacMam.
Os baculovirus utilízanse normalmente para a produción de glicoproteínas, aínda que as glicosilacións poden ser diferentes das que se encontran en vertebrados. En xeral, é máis seguro usalos que usar virus de mamíferos, xa que teñen un rango de hóspedes limitado e non infectan vertebrados sen modificacións.
Plantas
Moitos vectores de expresión en plantas están baseados no plásmido Ti de Agrobacterium tumefaciens. Nestes vectores de expresión, O ADN que vai ser inserido na planta é clonado no ADN-T, un tramo de ADN flanqueado por unha secuencia repetida directa de 25 pares de bases en ambos os extremos, e que pode integrarse no xenoma da planta. O ADN-T tamén contén o marcador seleccionable. Os Agrobacterium proporcionan un mecanismo para a transformación, a integración no xenoma da planta, e poden tamén utilizarse os promotores dos seus xenes vir para os xenes clonados. Porén, a preocupación polas posibles consecuencias da transferencia de material xenético bacteriano ou viral á planta levaron ao desenvolvemento de vectores chamados vectores intraxénicos, nos que se usan os equivalentes funcionais de xenoma de plantas para que non haxa transferencia de material xenético desde unha especie allea a unha planta.