miniatura|481x481px|As diferentes xeracións de nucleases usadas para a edición do xenoma e as vías de reparación do ADN usadas para modificar o ADN diana. A edición do xenoma (genome editing), edición de xenes ou enxeñaría xenómica é un tipo de enxeñaría xenética na cal o ADN se insire, elimina, modifica ou substitúe no xenoma dun organismo vivo. A diferenza das primeiras técnicas de enxeñaría xenética nas que se insería aleatoriamente material xenético no xenoma do hóspede, a edición do xenoma dirixe as insercións a localizacións específicas de sitio. O mecanismo básico implicado nas manipulacións xenéticas realizadas por medio de nucleases programables é o recoñecemento de loci xenéticos diana e a unión de endonucleases de restrición (FokI e Cas) a roturas de dobre febra (DSBs) do ADN diana, e a reparación de roturas de dobre febra por recombinación dirixida por homoloxía (HDR) ou unión de extremos non homólogos (NHEJ).
Historia
A edición do xenoma empezou na década de 1990, antes da aparición das actuais plataformas comúns de edición de xenes baseadas nas nucleases; porén, o seu uso estaba limitado pola baixa eficiencia da edición. A edición xenómica con nucleases preparadas por enxeñaría, é dicir, as tres grandes clases de encimas nucleases de dedo de cinc (ZFNs), nucleases efectoras similares a activadores da transcrición (TALENs) e meganucleases modificadas por enxeñaría, foi seleccionada pola revista Nature Methods como o Método do ano 2011. O sistema CRISPR-Cas foi seleccionado pola revista Science como Logro do ano 2015.
En 2015 utilizábanse catro familias de nucleases de enxeñaría: meganucleases, nucleases de dedo de cinc (ZFNs), nucleases efectoras similares a factores de transcrición (TALEN) e o sistema de repeticións palindrómicas curtas interespazadas regularmente agrupadas (CRISPR/Cas9). En 2017 dispoñíase de nove editores xenómicos.
En 2018 os métodos comúns para a edición utilizaban nucleases preparadas por enxeñaría ou "tesoiras moleculares". Estas nucleases crean roturas de dobre febra (DSBs) específicas de sitio nos lugares desexados do xenoma. As roturas de dobre febra inducidas son reparadas por unión de extremos non homólogos (NHEJ) ou recombinación homóloga (HR), o que orixina mutacións nos lugares diana ("edicións").
En maio de 2019 avogados da China informaron, á luz da suposta creación polo científico chinés He Jiankui dos primeiros xenes humanos editados, do borrador dunhas regulacións legais que estipulaban que calquera que manipulase o xenoma humano coas técnicas de edición de xenes, como CRISPR, sería responsable das consecuencias adversas que se puidesen producir. Recentemente abriuse unha discusión advertindo sobre os posibles puntos cegos e riscos do uso de CRISPR e biotecnoloxías relacionadas, enfocándose na natureza aleatoria dos procesos de control celular.
O Instituto Roslin da Universidade de Edimburgo preparou porcos modificados por enxeñaría resistentes a un virus que causa a síndrome respiratoria e reprodutiva porcina, que costa anualmente 2.600 millóns de dólares en perdas aos granxeiros de porcino europeos e norteamericanos.
En febreiro de 2020 un ensaio en EUA mostrou a seguridade do uso da edición de xenes con CRISPR en 3 pacientes de cancro. En 2020 a variedade de tomate Sicilian Rouge High GABA, que produce máis cantidade dun aminoácido que se di promove a relaxación, foi aprobada para a súa venda no Xapón.
En 2021 Inglaterra (pero non o resto do Reino Unido) planeou retirar as restricións á edición de xenes en plantas e animais, cambiando as anteriores regulacións concordantes coas da Unión Europea a regras máis parecidas ás dos Estados Unidos e outros países. Mesmo un informe da propia Comisión Europea de abril de 2021 atopou "fortes indicacións" de que o actual réxime regulador non era apropiado para a edición de xenes. Posteriormente en 2021, algúns investigadores anunciaron unha alternativa ao CRISPR consistente en usar proteínas etiquetadas de actividade guiada por elemento móbil (OMEGA), entre as cales estaban IscB, IsrB e TnpB, como endonucleases atopadas en transposóns, e guiadas por pequenos ARNω.
Introdución A enxeñaría xenética leva utilizándose desde a década de 1970 como método de introdución de novos elementos xenéticos en organismos. Unha desvantaxe desta tecnoloxía foi a natureza aleatoria coa cal o ADN se insire no xenoma do hóspede, que pode afectar ou alterar outros xenes do organismo. Porén, descubríronse varios métodos que dirixen os xenes inseridos a sitios específicos do xenoma. Isto tamén permitía a edición de secuencias específicas dentro dun xenoma así como reducía os efectos fóra da diana. Isto podía utilizarse en investigacións para dirixir a produción de mutacións a xenes específicos, e en terapia xénica. Inserindo un xene funcional nun organismo e utilizándoo para substituír un xene defectuoso, sería posible curar certas enfermidades xenéticas.
Gene targeting
Recombinación homóloga
Os métodos iniciais para dirixir xenes a certos puntos do xenoma dun organismo (chamados gene targeting) utilizaban a recombinación homóloga (HR). Ao crear construtos de ADN que conteñan un molde que se corresponda coa secuencia diana do xenoma é posible que os procesos de recombinación homóloga dentro da célula insiran o construto na localización desexada. O uso deste método en células nai embrionais levou ao desenvolvemento de ratos transxénicos nos que se aplicara knockout nos xenes diana. Tamén foi posible facer un knock-in de xenes ou alterar os padróns de expresión xénica. Mario Capecchi, Martin Evans e Oliver Smithies recibiron en 2007 o Premio Nobel de Medicina en recoñecemento polo seu descubrimento de como se pode usar a recombinación homóloga para introducir as modificacións xenéticas en ratos por medio de células nai embrionais.
Targeting condicional
Se un xene vital é sometido a knockout isto pode ser mortal para o organismo. Para estudar a función destes xenes utilizáronse recombinases específicas de sitio (SSR). Os dous tipos máis comúns son os sistemas Cre-LoxP e Flp-FRT. A recombinase Cre é un encima que elimina ADN por recombinación homóloga entre secuencias de unión coñecidas como sitios Lox-P. O sistema Flip-FRT funciona de xeito similar, co recoñecemento de secuencias FRT pola recombinase Flip. Cruzando un organismo que conteña os sitios de recombinase que flanquean o xene de interese cun organismo que expresa a recombinase específica de sitio baixo o control de promotores específicos de tecido, é posible causar un knockout ou interrupción en xenes de certas células. Estas técnicas tamén se utilizaron para eliminar marcadores de xenes de animais transxénicos. Outras modificacións destes sistemas permiten inducir a recombinación só baixo certas condicións, permitindo que os xenes sexan sometidos a knockout ou expresados en momentos desexados ou etapas do desenvolvemento.
Proceso
Reparación de roturas de dobre febra miniatura|350px|right|Vías de reparación das roturas de dobre febra e edición do xenoma usando nucleases CRISPR-Cas. Unha forma común de edición do xenoma depende do concepto da mecánica de reparación de roturas de dobre febra (DSB) no ADN. Hai dúas vías principais que reparan as roturas de dobre febra; a unión de extremos non homólogos (NHEJ) e a reparación dirixida por homoloxía (HDR). A unión de extremos non homólogos usa unha variedade de encimas para unirse directamente aos extremos do ADN, mentres que a máis exacta reparación dirixida por homoloxía usa unha secuencia homóloga como molde para a rexeneración de secuencias de ADN perdidas no punto de rotura. Isto pode ser aproveitado creando un vector cos elementos xenéticos desexados dentro dunha secuencia que é homóloga das secuencias flanqueantes dunha rotura de dobre febr. Isto resulta na inserción do cambio desexado no sitio da rotura de dobre febra. Mentres que a edición de xenes baseada na reparación dirixida por homoloxía é similar á recombinación homóloga baseada no gene targeting, a taxa de recombinación increméntase en polo menos tres ordes de magnitude.
Nucleases de enxeñaría
A clave da edición do xenoma é crear unha rotura de dobre febra nun punto específico do xenoma. Os encimas de restrición usados comunmente son efectivos para cortar o ADN, pero xeralmente recoñecen e cortan en múltiples sitios. Para superar este cambio e crear roturas de dobre febra específicas de sitio, descubríronse e preparáronse por bioenxeñaría ata agora tres clases de nucleases. Estas son as nucleases de dedo de cinc (ZFNs), as nucleases efectoras similares a activadores de transcrición (TALEN), as meganucleases e o sistema de repeticións palindrómicas curtas intespazadas regularmente agrupadas (CRISPR/Cas9).
Meganucleases As meganucleases, descubertas a finais da década de 1980, son encimas da familia das endonucleases que se caracterizan pola súa capacidade de recoñecer e cortar grandes secuencias de ADN (de 14 a 40 pares de bases). As meganucleases mellor coñecidas e espalladas son as proteínas da familia LAGLIDADG, que deben o seu nome a unha secuencia de aminoácidos conservada.
As meganucleases encóntranse comunmente en todas as especies microbianas e teñen a propiedade exclusiva de ter secuencias de recoñecemento moi longas (>14bp) o que as fai naturalmente moi específicas. Porén, non hai virtualmente ningunha oportunidade de encontrar a meganuclease exacta necesaria para actuar sobre unhas secuencias de ADN específicas escollidas. Para superar este reto, utilizáronse os métodos da mutaxénese e o cribado de alto rendemento para crear variantes da meganuclease que recoñecen secuencias únicas. Outros conseguiron fusionar varias meganucleases e crearon encimas híbridos que recoñecen unha nova secuencia. Outros intentaron alterar os aminoácidos que interaccionan co ADN da meganuclease para deseñar meganucleases específicas de secuencia cun método que produce as chamadas meganucleases deseñadas racionalmente. Finalmente, outra estratexia é o uso de modelos computacionais para tratar de predicir tan exactamente como sexa posible a actividade de meganucleases modificadas e a especificidade da secuencia de ácido nucleico recoñecida.
Creouse un gran banco que contiña varias decenas de miles de unidades de proteínas. Estas unidades poden combinarse para obter meganucleases quiméricas que recoñecen o sitio diana, proporcionando así as ferramentas de investigación e desenvolvemento que serven para unha ampla variedade de necesidades (investigación fundamental, saúde, agricultura, industria, enerxía, etc.). Entre estas está a produción escala industrial de dúas meganucleases capaces de cortar o xene humano XPC; as mutacións neste xene orixinan xeroderma pigmentosum, un trastorno monoxénico grave que predispón aos pacientes ao cancro de pel e queimaduras cando a súa pel se expón aos raios UV.
As meganucleases teñen a vantaxe de causar menos toxicidade nas células que métodos como a da nuclease de dedo de cinc (ZFN), probablemente debido ao recoñecemento máis estrito da secuencia de ADN; porén, a construción de encimas específicos de secuencia de todas as secuencias posibles é caro e leva moito tempo, e non se beneficia das posibilidades combinatorias de métodos como as que utilizan fusións baseadas en TALEN e ZFNs.
Nucleases de dedo de cinc