miniatura|dereita|Colocación de viais de PCR nun termociclador. miniatura|Xel de agarosa tinguido con bromuro de etidio que mostra varios produtos de PCR obtidos mediante distintos cebadores, cun baixo nivel de especificidade.
A reacción en cadea da polimerase, coñecida como PCR (do inglés polymerase chain reaction), é unha técnica de bioloxía molecular desenvolvida en 1987 por Kary Mullis, Bartlett J.M.S., Stirling D. (2003) A Short History of the Polymerase Chain Reaction. In: Methods Mol Biol. 226:3-6,DOI 10.1385/1-59259-384-4:3 que ten como obxectivo obter un gran número de copias dun fragmento de ADN particular, partindo dunha cantidade mínima. En teoría abondaría partir dunha única copia dese fragmento orixinal, ou molde.
Esta técnica serve para amplificar un fragmento de ADN. A súa utilidade é que trala amplificación é moito máis fácil identificar cunha moi alta probabilidade, virus ou bacterias causantes dunha enfermidade, identificar persoas (cadáveres) ou facer investigacións científicas sobre o ADN amplificado. Estes usos derivados da amplificación fixeron que se convertise nunha técnica moi utilizada, o que supuxo o abaratamento do equipo necesario para levala a cabo.
Fundamento e importancia
Esta técnica fundaméntase na propiedade natural das ADN polimerases de replicar fibras de ADN, para o cal se empregan ciclos de altas e baixas temperaturas alternadas para separar as dúas cadeas do ADN acabado de formar tras cada fase de replicación e, seguidamente, deixar que as fibras de ADN volvan a unirse para poder duplicalas novamente. A reacción en cadea da polimerase foi perfeccionada por Kary Mullis cando traballaba na Cetus Corporation en California, na década de 1980.
Inicialmente a técnica era lenta, xa que as polimerases se desnaturalizaban ao realizar os cambios de temperatura e era necesario engadir novas polimerases en cada ciclo. Como as temperaturas ás que funcionaba o ciclo (95 °C nas fases de desnaturalización do ADN) supoñen a inmediata desnaturalización das proteínas, empréganse ADN polimerases termoestables, extraídas de microorganismos adaptados a vivir a esas temperaturas, restritivas para a maioría dos seres vivos. Ditos microorganismos, xeralmente arqueas, son: Thermus aquaticus (Taq polimerase), Pyrococcus furiosus (Pfu polimerase), Thermococcus litoralis (Vent) e Thermus thermophilus (Tth). Xeralmente empréganse mesturas de polimerases moi procesivas (Taq) con outras con capacidade de realizar corrección de erros (Pfu, Vent).
miniatura|Termociclador: aparello no que se efectúa a PCR convencional. Hoxe, todo o proceso da PCR está automatizado nun aparello chamado termociclador, que permite quentar e arrefriar os tubos de reacción para controlar a temperatura necesaria para cada fase da reacción. Moitos termocicladores modernos usan o efecto Peltier, que permite tanto quentar coma arrefriar os tubos simplemente invertendo a corrente eléctrica. Os tubos usados para PCR teñen unha parede moi fina, o que favorece unha boa condutividade térmica, permitindo que se acade rapidamente o equilibrio térmico. Case todos os termocicladores teñen un sistema que quenta a tapa de peche coa finalidade de evitar a condensación sobre os tubos de reacción. Os termocicladores máis antigos carecían deste sistema e solucionaban o problema da condensación cunha capa de aceite na parte superior da mestura de reacción ou cun pouco de cera dentro dos tubos.
En xeral, a PCR é unha técnica común e normalmente indispensable en laboratorios de investigación médica e biolóxica para unha gran variedade de aplicacións. Entre elas inclúense a clonación de ADN para a secuenciación, a filoxenia baseada en ADN, a análise funcional de xenes, o diagnóstico de trastornos hereditarios, a identificación de pegadas xenéticas (usada en técnicas forenses e nas probas de paternidade) e a detección e diagnóstico de enfermidades infecciosas.
Reactivos miniatura|Tubos de PCR que conteñen a mestura nun volume total de 100 μL. Para realizar a técnica cómpre o seguinte:
Os 4 desoxirribonucleósidos-trifosfato (dNTP), substratos para polimerizar o novo ADN. Dous cebadores ou iniciadores (en inglés, primers), oligonucleótidos que son complementarios a unha parte das dúas fibras do ADN, un cebador para unha das fibras e o outro para a outra. Son secuencias curtas, de entre seis e corenta nucleótidos, normalmente de dezaoito a vinte e dous, que permiten que a polimerase inicie a reacción. Deben estar enfrontados e a non moita distancia. Delimitan a zona de ADN a amplificar, é dicir, corresponden aos nucleótidos que definen os extremos da secuencia que se desexa replicar. Ións divalentes. Adoita usarse o magnesio (Mg2+), engadido xeralmente como cloruro de magnesio (MgCl2), ou algún outro catión divalente. Tamén se pode empregar manganeso (Mn2+), para mutaxénese de ADN mediante PCR, xa que altas concentracións de Mn2+ incrementan a taxa de erro durante a síntese de ADN. Actúan como cofactores da polimerase. Ións monovalentes, como o potasio. Unha solución tampón ou buffer que mantén o pH axeitado para o funcionamento da ADN polimerase. ADN polimerase ou mestura de distintas polimerases con temperatura óptima arredor de 70 °C (a máis común é a Taq polimerase). ADN molde, que contén a rexión de ADN que se vai amplificar. Termociclador, o aparello que mantén a temperatura necesaria en cada unha das fases que forman un ciclo.
Conceptos utilizados na PCR
Sensibilidade: refírese á cantidade mínima de ADN necesaria para que se produza a amplificación, é dicir, para obter unha banda. Relaciónase cos falsos negativos, xa que pode que unha mostra sexa en realidade positiva pero o resultado dea negativo porque non se amplificou por non ter unha cantidade de ADN dabondo. Especificidade: refírese á obtención dun só produto amplificado. Está determinada polos oligos e a especificidade con que se unen ao ADN molde. Desta forma, se os oligos teñen máis dun sitio ao que se poden unir aparecerá máis dun produto amplificado. Eficiencia: refírese á amplificación máxima que se pode obter nun número determinado de ciclos. Fidelidade: refírese aos erros que comete a ADN polimerase durante a amplificación. Este concepto é de especial importancia na secuenciación, pero noutros casos non é tan importante. Unha boa fidelidade permite evitar falsos positivos e falsos negativos.
Ciclo de amplificación
miniatura|300px|Esquema xeral da PCR. miniatura|300px|Grao de amplificación segundo o número de ciclos empregados. A: xel de agarosa (1: ladder (escada), 2: produto específico, 3: produto inespecífico); B concentración de ADN con respecto ao tempo; C logaritmo da concentración de ADN con respecto ao tempo. O proceso da PCR polo xeral consiste en realizar unha serie de 20 a 35 cambios repetidos de temperatura chamados ciclos; cada ciclo adoita constar de 2-3 pasos a diferentes temperaturas. A PCR común realízase con ciclos que teñen tres pasos de temperatura. Os pasos de ciclo a miúdo están precedidos por un choque térmico (chamado "hold") a alta temperatura (> 90 °C), e seguido por outro ao final do proceso para a extensión do produto final ou o breve almacenamento. As temperaturas usadas e o tempo aplicado en cada ciclo dependen de moitos factores. Estes inclúen o encima usado para a síntese de ADN, a concentración de ións divalentes e dos dNTP na reacción, e a temperatura de unión dos cebadores, e a lonxitude do ADN que se desexa amplificar.
Actualmente, case todos os termocicladores dan a opción de realizar a reacción da PCR coa chamada " tapa quente". Isto consiste en que o sistema do termociclador aplicará calor á parte de arriba do vial que contén a mestura de PCR. Ao comezo, os laboratorios que empezaron a usar os primeiros aparellos que se comercializaron e que non incluían este sistema tiñan que poñer unhas pingas de aceite dentro do vial. O obxectivo deste procedemento, igual que o da tapa quente, é evitar a condensación da mostra, xa que no tubo Eppendorf encóntranse dúas fases: líquido e gas. Ao condensar a mostra, pérdese volume da mestura. Porén, quentando a tapa ou poñendo as pingas de aceite evítase este proceso físico, conservando case intacto o volume da mostra.
Inicio
Este paso consiste en levar a reacción ata unha temperatura de 94-96 °C (ou 98 °C se se está usando unha polimerase termoestable extrema), que se mantén durante 1-9 minutos. Isto só é necesario para ADN polimerases que requiran activación por calor.
Desnaturalización
En primeiro lugar, desnaturalízase o ADN (sepáranse as dúas cadeas das que está formado). Este paso pode realizarse de diferentes xeitos, pero o máis habitual é o quentamento (a 94-95 °C) da mostra. A temperatura á cal se decide realizar a desnaturalización depende, por exemplo, da proporción de G+C que teña a cadea, e tamén da lonxitude da mesma. Outros métodos, raramente empregados na técnica da PCR, serían a adición de sales ou axentes químicos capaces de realizar a desnaturalización.
Aliñamento ou unión do cebador
A continuación prodúcese a hibridación do cebador, é dicir, o cebador únese á súa secuencia complementaria no ADN molde. Isto chámase annealing. Para que se produza cómpre baixar a temperatura a 40-68 °C durante 20-40 segundos (dependendo do caso). As pontes de hidróxeno estables entre as cadeas de ADN (unión ADN-ADN) só se forman cando a secuencia do cebador é moi similar á secuencia do ADN molde. A polimerase únese ao híbrido entre a cadea molde e o cebador, e empeza a sintetizar ADN. Os cebadores actuarán como límites da rexión da molécula que vai ser amplificada.
Extensión ou elongación da cadea
Actúa agora a ADN polimerase, tomando o ADN molde para sintetizar a cadea complementaria e partindo do cebador como soporte inicial necesario para a síntese de novo ADN. A polimerase sintetiza unha nova fibra de ADN complementaria á fibra molde engadindo os dNTP complementarios en dirección 5'→ 3', unindo o grupo 5'-fosfato dos dNTP co grupo 3'-hidroxilo do final da fibra de ADN en crecemento (a cal se estende). A temperatura para este paso depende da ADN polimerase que usemos. Para a Taq polimerase, a temperatura de máxima actividade está en 75-80 °C (normalmente 72 °C). O tempo de extensión depende tanto da ADN polimerase usada coma da lonxitude do fragmento de ADN que se vai amplificar. Hai unha regra comunmente usada: na súa temperatura óptima, a polimerase de ADN polimerizará mil bases por minuto.
Elongación final
Fase única que se leva a cabo a unha temperatura de 70-74 °C durante 5-15 minutos tralo último ciclo de PCR. Con ela asegúrase que calquera ADN de cadea simple restante sexa totalmente ampliado.
Conservación
Este é un paso que se realiza a 4-15 °C durante un tempo indefinido para conservar a reacción a curto prazo.
A PCR realízase normalmente cun volume de reacción de 15-100 μL, en pequenos tubos de 0,2-0,5 mL que se colocan no termociclador.
Para verificar que a PCR xerou o fragmento de ADN previsto, empréganse técnicas de electroforese, que separan os fragmentos de ADN xerados de acordo á súa carga, isto é, lonxitude, e, en menor medida e dependendo da matriz empregada, ao seu tamaño: tipicamente emprégase a electroforesis en xel de agarosa, para fragmentos grandes; en acrilamida, para os máis pequenos; e, de forma máis rápida e aplicable á PCR asociada a marcaxe fluorescente, a electroforese capilar. O(s) tamaño(s) do(s) produto(s) da PCR está(n) determinados por un marcador de masa molecular de ADN, o cal contén fragmentos de ADN de tamaño coñecido, e que se fai correr no xel xunto cos produtos de PCR.
Optimización da PCR
Na práctica, a PCR pode fallar por varias razóns, entre elas están: