bélyegkép|350x350px|Agaróz gél membránra helyezése az elektroforézis után. A Southern blot egy molekuláris biológiai módszer, aminek segítségével az adott DNS mintából specifikus DNS szakaszok kimutatása válik lehetővé. A módszer során az agaróz gélelektroforézis teszi lehetővé a DNS szakaszok méret szerinti elválasztását, majd az így kapott frakciókat általában nitrocellulóz membránon kötik meg (blottolás). A membránon az elválasztással kapott mintázat és a specifikus szekvenciát tartalmazó DNS szakaszok nyomai is láthatóvá tehetők a megfelelő festékekkel. A vizsgálat eredményét általában a membrán szkennelésével vagy fotózásával (radioaktív jelölőanyag esetén röntgenfilmmel) dokumentálják.
A módszert Edwin M. Southern brit biológusról nevezték el, aki 1975-ös cikkében először írta le a technika alapjait. Az ötlete nem csak a DNS vizsgálatában hozott áttörést, mivel következő években a munkafolyamat kisebb módosításokkal számos másik biomolekula elválasztására és analízisére is alkalmasnak bizonyult. Ezek az ún. blottolásos (blotting) módszerek az eredeti feltaláló neve után szintén égtájak angol nevét kapták. +Módszer neveLeírás éveGélmátrix anyagaMembrán anyagaFelhasználásSouthern blot1975agaróznitrocellulóz, nylonDNS szakaszok elválasztása méret alapján és a specifikus szekvenciát tartalmazók detektálásaNorthern blot1975agaróz formaldehiddelnylonRNS szakaszok elválasztása méret alapján és a specifikus szekvenciát tartalmazók detektálásaWestern blot1979poliakrilamidpolivinilidén-fluorid (PVDP), nirocellulózFehérjék és polipeptidek elválasztása méret alapján és a specifikus szerkezettel rendelkezők detektálásaSouthwestern blot1980poliakrilamidnirocellulózDNS-hez kötődő fehérjék elválasztása méret alapján és különböző DNS szekvenciákat vagy peptidszerkezeteket tartalmazó komplexek detektálása.Eastern blot1982poliakrilamidpolivinilidén-fluorid (PVDP), nirocellulózFehérjék és polipeptidek elválasztása méret alapján és a különböző poszttranszlációs módosulásokkal rendelkezők detektálásaNorthwestern blot1984poliakrilamidnirocellulózRNS-hez kötődő fehérjék elválasztása méret alapján és különböző RNS szekvenciákat vagy peptidszerkezeteket tartalmazó komplexek detektálása.Far-western blot1994poliakrilamidpolivinilidén-fluorid (PVDP), nirocellulózFehérjekomplexek elválasztása méret alapján és a különböző fehérje-fehérje kölcsönhatásokFar-eastern blot2000Lipidekhez kapcsolódó oligoszacharidok elválasztása méret alapján és a különböző lipid-oligoszacharid kölcönhatások detektálása
A módszer A nagyobb (akár genomi méretű) DNS-t kisebb szakaszokra hasítják restrikciós endonukleázok segítségével. A DNS-t ezután denaturálják nátrium-hidroxid segítségével, melynek következtében a DNS két szála elválik egymástól. Nitrocellulóz vagy nylon membránt helyeznek a gél tetejére, amire több rétegben papírtörölköző kerül. A kapillárishatás miatt a minták felfelé mozdulnak el, kikötődnek a membránra, megőrizve a gélbeli egymáshoz viszonyított helyzetüket. Nitrocellulóz membrán esetében száraz hőkezelés (60-100 °C), nylonmembrán esetében UV kezelés következik, ekkor történik meg a DNS-membrán kovalens keresztkötése. Majd a membránt hibridizációs jelzővegyülettel (probe) kezelik – ami egy olyan specifikus szekvenciával rendelkező DNS molekula, mely a vizsgálni kívánt szakasszal komplementer, és radioaktív izotópot tartalmazó, fluoreszcens vagy kromogenikus (bizonyos körülmények között színessé tehető) funkciós csoporttal van ellátva. A nem hibridizált jelzővegyületeket lemossák a felületről, és a hibridizációs mintázatot Röntgen-filmen autoradiográfiával vagy fluorescens jelölés esetén fluorométerrel, esetleg a kromogén szubsztát alkalmazásával enzimatikus színreakcióval teszik láthatóvá.
Az eredmény
A próba megmutatja, hogy az elektroforetikus elválasztás mely fragmentumai tartalmaznak egy bizonyos DNS szekvenciát.
Jegyzetek
Kapcsolódó szócikkek Restrikciós fragment hossz-polimorfizmus DNS ujjlenyomat
Kategória:Molekuláris biológia