Le DNA polimerasi termostabili sono DNA polimerasi, che provengono da esseri termofili, come batteri o archeobatteri, e perciò sono termostabili. Sono utilizzate per la reazione a catena della polimerasi e metodi prossimi alla modificazione del DNA.

Polimerasi batteriche Le DNA polimerasi termostabili di origine naturale vengono da batteri termostabili, da archaei termostabili e dal loro patogeni. Tra le DNA polimerasi termostabili da batterie (tipo A) si usano le DNA polimerasi termostabili Taq, Tfl, Tma, Tne e la Tth.J. Cline, J. C. Braman, H. H. Hogrefe: PCR fidelity of pfu DNA polymerase and other thermostable DNA polymerases. In: Nucleic Acids Res., Bd. 24, Nr. 18, 1996, S. 3546–3551. PMID 8836181; .B. Villbrandt, H. Sobek, B. Frey, D. Schomburg: Domain exchange: chimeras of Thermus aquaticus DNA polymerase, Escherichia coli DNA polymerase I and Thermotoga neapolitana DNA polymerase. In: Protein Eng., Bd. 13, Nr. 9, 2000, S. 645–654. PMID 11054459.W. Abu Al-Soud, P. Râdström: Capacity of nine thermostable DNA polymerases to mediate DNA amplification in the presence of PCR-inhibiting samples. In: Appl. Environ. Microbiol., Bd. 64, Nr. 10, 1998, S. 3748–3753. PMID 9758794; . Hanno un'attività polimerasica in direzione 5ʾ→3ʾ e un'attività esonucleasica 5ʾ→3ʾ e aggiungono un'adenosina al termine 3' del filamento DNA sintetizzato (ingl. ). La processività (engl. ) descrive il numero di basi sintetizzate prima di lasciare il filamento di origine (ingl. ). La processività limita la distanza tra la polimerasi ed il probe nel real time PCR. La processività della DNA polimerasi Taq è di circa 200 basi.

Polimerasi archaeici

Tra le DNA polimerasi termostabili archaeiche (tipo B) si usano la Pfu DNA polimerasi, Pwo, KOD,M. Takagi, M. Nishioka, H. Kakihara, M. Kitabayashi, H. Inoue, B. Kawakami, M. Oka, T. Imanaka: Characterization of DNA polymerase from Pyrococcus sp. strain KOD1 and its application to PCR. In: Appl. Environ. Microbiol., vol. 63, n. 11, 1997, pp. 4504–4510. PMID 9361436; . Tli (sinonimo Vent),H. Kong, R. B. Kucera, W. E. Jack: Characterization of a DNA polymerase from the hyperthermophile archaea Thermococcus litoralis. Vent DNA polymerase, steady state kinetics, thermal stability, processivity, strand displacement, and exonuclease activities, in: J Biol Chem., vol. 268, n. 3, 1993, pp. 1965–1975. PMID 8420970. Tag,K. Böhlke, F. M. Pisani, C. E. Vorgias, B. Frey, H. Sobek, M. Rossi, G. Antranikian: PCR performance of the B-type DNA polymerase from the thermophilic euryarchaeon Thermococcus aggregans improved by mutations in the Y-GG/A motif, in: Nucleic Acids Res., vol. 28, n. 20, 2000, pp. 3910–3917. PMID 11024170; . Tce,K. P. Kim, H. Bae, I. H. Kim, S. T. Kwon, Cloning, expression, and PCR application of DNA polymerase from the hyperthermophilic archaeon, Thermococcus celer, in: Biotechnol Lett. (2011), vol. 33, n. 2, pp. 339-346. PMID 20953664. Tgo, TNA1,Y. Cho, H. S. Lee, Y. J. Kim, S. G. Kang, S. J. Kim, J. H. Lee: Characterization of a dUTPase from the hyperthermophilic archaeon Thermococcus onnurineus NA1 and its application in polymerase chain reaction amplification, in: Mar Biotechnol (NY), vol. 9, n. 4, 2007, pp. 450–458. PMID 17549447. Tpe,J. I. Lee, Y. J. Kim, H. Bae, S. S. Cho, J. H. Lee, S. T. Kwon: Biochemical properties and PCR performance of a family B DNA polymerase from hyperthermophilic euryarchaeon Thermococcus peptonophilus, in: Appl Biochem Biotechnol., vol. 160, n. 6, 2010, pp. 1585–1899. PMID 19440663. Tthi,D. Marsic, J. M. Flaman, J. D. Ng: New DNA polymerase from the hyperthermophilic marine archaeon Thermococcus thioreducens, in: Extremophiles, vol. 12, n. 6, 2008, pp. 775–788. PMID 18670731. NeqJ. G. Song, E. J. Kil, S. S. Cho, I. H. Kim, S. T. Kwon: An amino acid residue in the middle of the fingers subdomain is involved in Neq DNA polymerase processivity: enhanced processivity of engineered Neq DNA polymerase and its PCR application, in: Protein Eng. Des. Sel., vol. 23, n. 11, 2010, pp. 835–842. PMID 20851826. e Pab.J. Dietrich, P. Schmitt, M. Zieger, B. Preve, J. L. Rolland, H. Chaabihi, Y. Gueguen: PCR performance of the highly thermostable proof-reading B-type DNA polymerase from Pyrococcus abyssi, in: FEMS Microbiol Lett., vol. 217, n. 1, 2002, pp. 89–94. PMID 12445650.

Le polimerasi termostabili del tipo B non producono una base alla fine del filamento nascente (ingl. ). Solo la polimerasi Tli aggiunge un'adenosina nel 30 % dei filamenti. Invece di un'attività esonucleasica 5ʾ→3ʾ c'è un'attività esonucleasica 3ʾ→5ʾ per la correzione degli errori di sintesi (ingl. ).E. M. Kennedy, C. Hergott, S. Dewhurst, B. Kim: The mechanistic architecture of thermostable Pyrococcus furiosus family B DNA polymerase motif A and its interaction with the dNTP substrate, in: Biochemistry, vol. 48, n. 47, 2009, pp. 11161-8. PMID 19817489; .T. Kuroita, H. Matsumura, N. Yokota, M. Kitabayashi, H. Hashimoto, T. Inoue, T. Imanaka, Y. Kai: Structural mechanism for coordination of proofreading and polymerase activities in archaeal DNA polymerases, in: J Mol Biol., vol. 351, n. 2, 2005, pp. 291-298. PMID 16019029. Con le polimerasi del tipo B si può produrre un frammento Klenow analogamente alla DNA polimerasi del tipo A attraverso una proteolisi, ma l'attività esonucleasica è remota nel processo, che aumenta la disposizione a generare errori. Qualche DNA polimerasi è meglio utilizzata per l'amplificazione del aDNA.J. P. McDonald, A. Hall, D. Gasparutto, J. Cadet, J. Ballantyne, R. Woodgate: Novel thermostable Y-family polymerases: applications for the PCR amplification of damaged or ancient DNAs, in: Nucleic Acids Res. (2006), vol. 34, n. 4, 2006, pp. 1102-11. PMID 16488882; .

Polimerasi modificati Attraverso di un protein engineering qualche polimerasi viene costruito fuso alla DNA clamp della proteina SSo7d per ridurre gli errori di sintesi (Q5-Polymerase).Y. Wang, D. E. Prosen, L. Mei, J. C. Sullivan, M. Finney, P. B. Vander Horn: A novel strategy to engineer DNA polymerases for enhanced processivity and improved performance in vitro. In: Nucleic Acids Res. (2004), Bd. 32(3), S. 1197-207. PMID 14973201; . La proteina PCNA da Archaeoglobus fulgidus era combinata con polimerasi termostabili.M. Motz, I. Kober, C. Girardot, E. Loeser, U. Bauer, M. Albers, G. Moeckel, E. Minch, H. Voss, C. Kilger, M. Koegl: Elucidation of an archaeal replication protein network to generate enhanced PCR enzymes. In: J Biol Chem. (2002), Band 277(18), S. 16179-88. PMID 11805086. PDF. Analogamente polimerasi termostabili è costruiti con la topoisomerasi (di tipo V, con motivo Helix-hairpin-Helix, HhH) da Methanopyrus kandleri (TopoTaq e PfuC2). Una polimerasi modificata è costruito (Pfu Ultra).Holly H. Hogrefe, M. Borns: High fidelity PCR enzymes. In: C.W. Dieffenbach, G.S. Dveksler (Eds.): PCR Primer: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 2003. Effetti simili sono ottenuti con un'unione di polimerasi del tipo A e B,W. M. Barnes: PCR amplification of up to 35-kb DNA with high fidelity and high yield from lambda bacteriophage templates. In: Proc Natl Acad Sci U S A (1994), Bd. 91(6), S. 2216-20. PMID 8134376; . per esempio la Herculase come un'unione delle polimerasi Taq e Pfu.

La velocità di sintesi (ingl. ) delle polimerasi termostabili sono state comparate. La velocità di sintesi della Taq è circa 60 coppie di basi per secondo. Tra le polimerasi termostabili solo la KOD ha una rata superiore di 100 coppie di basi per secondo (circa 120 bp/s). Mutazioni diverse sono descritti che aumentano la velocità di sintesi. La KOD e qualche polimerasi termostabile modificate con (iProof, Pfu Ultra, Phusion, Velocity o Z-Taq) sono utilizzate per una PCR rapida (Fast-PCR, High-speed PCR).

Le quote di errori delle polimerasi termostabili (ingl. ) sono pubblicati. La quota di errori della Taq è 8 · 10−6 errori per coppia di basi, la quota della KOD è 3,5 · 10−6 errori per coppia di basi, la quota della Tli e della Herculase è 2,8 · 10−6 errori per coppia di basi, la quota della Pfu è 1,3 · 10−6 errori per coppia di basi e la quota della Pfu Ultra è 4,3 · 10−7 errori per coppia di basi.

Le polimerasi batteriche possono essere modificate analogamente alla DNA polimerasi da E. coli. Da una delezione dell'esonucleasi della Taq nasce un frammento Klen-Taq o un frammento Stoffel, che producono più DNA.W. M. Barnes: The fidelity of Taq polymerase catalyzing PCR is improved by an N-terminal deletion. In: Gene (1992), Band 112(1), S. 29-35. PMID 1551596. Due amminoacidi sono necessari per l'esonucleasi della Taq e sono Arginine nelle posizioni 25 e 74 (R25 e R74).L. S. Merkens, S. K. Bryan, R. E. Moses: Inactivation of the 5'-3' exonuclease of Thermus aquaticus DNA polymerase. In: Biochim Biophys Acta (1995), Band 1264(2), S. 243-8. PMID 7495870.

Note

Bibliografia

Collegamenti esterni Promega: Properties of Thermostable DNA Polymerases (PDF; 208 kB). Richiesto il 27. settembre 2012. NEB Polbase . Richiesto il 27. settembre 2012. Fermentas DNA-polymerases . Richiesto il 27. settembre 2012.

Categoria:Enzimi