Clostridioides difficile, una volta conosciuto come Clostridium difficile, è un batterio sporigeno appartenente alla famiglia Clostridiaceae. È un bastoncello, Gram +, anaerobio. Come altre specie affini, quando produce specifiche tossine, può essere patogeno per l'uomo.
Ampiamente diffuso nel suolo è presente anche nell’apparato gastrointestinale di vari animali: cani, gatti, cavalli, maiali, roditori. Il C. difficile fa parte della normale flora saprofita dell’intestino umano e colonizza tra il 3% e il 15% degli adulti sani. Può essere isolato nell'80% delle feci dei bambini fino a 1 anno di età, colonizzazione favorita dall’immaturità della flora batterica intestinale.
La specie C. difficile è definita da un grande e diversificato pangenoma con livelli estremi di plasticità evolutiva che è stata modellata per lunghi periodi di tempo dal flusso genico e dalla ricombinazione, spesso tra lignaggi divergenti. Sono stati isolati centinaia di diversi ceppi del C. difficile, non tutti tossigeni. La continua evoluzione del C. difficile in risposta alle attività ambientali e antropiche ha portato alla rapida comparsa e alla diffusione in tutto il mondo di lignaggi clonali virulenti.
L'infezione da Clostridioides difficile è, in alcuni paesi, la causa più comune di infezioni nosocomiali e causerebbe circa 15 000 morti l'anno negli USA e 3 700 nella UE/EEAA.
Il costo attribuibile per ogni caso di infezione nosocomiale da Clostridioides difficile in Italia è di 14023 euro. Storia Hall e O'Toole, in materiale fecale di neonati, nel 1935 individuarono il batterio: Bacillus difficilis, chiamato così per la difficoltà incontrata nell'isolamento e per l'estrema lentezza di crescita dello stesso sul terreno colturale. Nel 1970 fu rinominato come Clostridium difficile. Mentre il primo caso di colite pseudomembranosa era stato documentato da Finney nel 1893 in un'autopsia di una donna, morta per una diarrea emorragica post-intervento chirurgico, che presentava pseudomembrane simil-difteriche nel colon.
Nel 1968 su criceti, normalmente usati per lo studio del C. difficile, trattati con l'antibiotico lincomicina si osservò la comparsa di una grave colite pseudomembranosa sperimentale mortale.
Nel 1970 animali trattati con antibiotici presentavano un'alta quantità nelle feci di tossina patogena prodotta dal C. difficile, individuando con la tossina la causa primaria delle manifestazioni cliniche della patologia della colite pseudomembranosa. Nel 1980 furono individuate due distinte tossine (A e B) prodotte dal C. difficile. Le tossine A e B sono trascritte su un locus di patogenicità che comprende cinque geni: due geni della tossina, tcdA (tossina A) e tcdB (tossina B), e tre geni regolatori, uno dei quali (tcdC) codifica un regolatore negativo della trascrizione della tossina.
La prima sequenza genomica completa di un ceppo di C. difficile è stata pubblicata per la prima volta nel 2005 dal Sanger Institute nel Regno Unito. Si trattava del ceppo 630, un ceppo virulento e resistente ai farmaci isolato in Svizzera nel 1982.
La specie è stata trasferita dal genere Clostridium a Clostridioides nel 2016, dandole così il binomio Clostridioides difficile. Questo nuovo nome riflette le differenze tassonomiche tra questa specie e i membri del genere Clostridium, mantenendo però allo stesso tempo l'abbreviazione C. difficile.
Batteriologia
Troviamo spore di Clostridioides difficili nel terreno, negli ospedali e nelle case per anziani. La forma attiva dei batteri si trova solo nel tratto intestinale . Al microscopio, dopo la colorazione di Gram, sono bacilli allungati con un'estremità leggermente gonfia. Il germe stesso è gram-positivo. La sua cultura è ottimale in ambiente basico di agar a 37 °C. Quando le condizioni si fanno difficili, i batteri producono spore resistenti all'essiccazione, a temperature estreme e a molti prodotti chimici e disinfettanti..
Le spore sono metabolicamente dormienti e altamente resistenti alle procedure di disinfezione standard, consentendo loro di persistere per lunghi periodi nell'ambiente. Le spore ingerite da ospiti sensibili possono riattivarsi (o germogliare) in risposta a specifici acidi biliari nell'intestino tenue e tornare a uno stile di vita attivo per produrre tossine e causare malattie. Le spore sono altamente trasmissibili e responsabili della contaminazione degli ambienti. Il Clostridioides difficile è un germe della flora digestiva commensale. Rilevato anche nelle feci degli infanti è spesso asintomatico per l'incapacità della tossina, nei ceppi tossigenici, di legarsi ai recettori degli enterociti ancora immaturi. Alcune sue mutazioni emergenti sono multi-resistenti (si sono adattate alla maggior parte degli antibiotici) e in caso di disturbo della flora digestiva provocato dalla somministrazione di antibiotici, possono svilupparsi in modo significativo. La grande variabilità dei diversi ceppi rende difficile la loro caratterizzazione molecolare. Quando nel 2003 l'analisi molecolare ha portato all'identificazione di un ceppo di C. difficile caratterizzato come gruppo BI mediante analisi di endonucleasi di restrizione, NAP1 (nordamericano a campo pulsato) mediante elettroforesi su gel a campo pulsato e ribotipo 027, il "nuovo" ceppo è stato chiamato "C. difficile BI / NAP1 / 027". La diversa terminologia riflette le tecniche predominanti utilizzate per la tipizzazione epidemiologica.Spigaglia, P., Barbanti, F., Mastrantonio, P., European Study Group on Clostridium difficile (ESGCD), Ackermann, G., Balmelli, C., … & Drudy, D. (2011). Multidrug resistance in European Clostridium difficile clinical isolates. Journal of Antimicrobial Chemotherapy, 66(10), 2227-2234.Kuijper, E. J., van den Berg, R. J., Debast, S., Visser, C. E., Veenendaal, D., Troelstra, A., … & Notermans, D. W. (2006). Clostridium difficile ribotype 027, toxinotype III, the Netherlands. Emerging infectious diseases, 12(5), 827.
Del C. difficile esistono sia ceppi tossigenici (cioè produttori di tossine) sia non tossigenici, ma solo le forme tossigeniche sono causa di malattia negli esseri umani.
I batteri producono citotossine polipeptidiche ad alta massa molecolare, A e B. Alcuni ceppi producono solo una delle tossine, altri producono entrambe. La tossina A provoca una reazione infiammatoria che coinvolge l'ipersecrezione di liquido e la necrosi emorragica attraverso l'attivazione del rilascio di citochine da parte dei neutrofili. La citotossina B depolimerizza l'actina, la principale proteina del citoscheletro, e quindi aiuta nella distruzione dei tessuti. L'azione combinata delle tossine provoca necrosi dell'epitelio superficiale ed edema (gonfiore fluidico) nelle zone dell'intestino colpite. La proliferazione del C. difficile è normalmente contrastata dalla normale microflora intestinale, che si ritiene inibisca l'attaccamento del batterio e delle sue tossine alle pareti intestinali. L'alterazione dell'equilibrio microbico intestinale con la terapia antibiotica e la maggiore esposizione al batterio in ambiente ospedaliero consente al C. difficile di colonizzare individui suscettibili. Inoltre, è stato dimostrato che le concentrazioni subinibitorie di antibiotici promuovono una maggiore produzione di tossine da parte di C. difficile. Ceppi Il C. difficile è tassonomicamente distinto da molti altri ben noti clostridi, con una struttura di popolazione diversificata che comprende centinaia di ceppi diversi sparsi in almeno 6 cladi filogenetici. Del C. difficile esistono sia ceppi tossigenici (cioè produttori di tossine) sia non tossigenici, ma solo le forme tossigeniche sono causa di malattia negli esseri umani. La patogenicità dipende infatti dalla presenza delle tossine A (TcdA, enterotossina) e B (TcdB, citotossina). Sono stati identificati oltre 400 diversi ceppi tossigenici.
Tutti i ceppi tossigenici esprimono la tossina TcdB, con o senza la tossina TcdA. La tossina B ha infatti attività citotossica più potente della tossina A. Entrambe le tossine sopravvivono nell’ambiente acido dello stomaco e sono in grado di legarsi alla superficie delle cellule epiteliali delle mucose intestinali dove vengono internalizzate e dove catalizzano la glicosilazione di alcune proteine citoplasmatiche, con successiva morte cellulare. Una terza tossina di cui non è chiara la patogenicità, la tossina binaria (CDT), è prodotta da alcuni ceppi di C. difficile. Questa tossina ha dimostrato di incrementare la virulenza di C. difficile attraverso l’adenosina difosfato-ribosilazione di actina, inducendo la formazione di protrusioni di microtubuli nelle cellule facilitando l’adesione del batterio sulla superficie cellulare. La tossina CDT può essere presente anche nei ceppi dove le tossine A e B sono assenti, riscontrati nei pazienti asintomatici.
Esistono ceppi che producono quantità massive di tossine comparsi sin dal 2000. In particolare, C. difficile PCR-ribotipo 027 (BI/NAP1/027) è stato associato a un aumento della gravità dei casi, delle ricorrenze e della mortalità. Il ceppo produce entrambe le tossine in gran quantità a causa di una mutazione (delezione) del gene regolatore tdcC e possiede, analogamente ad altre specie di Clostridi, la tossina binaria CDT. Oltre allo 027, anche altri ribotipi epidemici considerati ipervirulenti sono emersi, alcuni a diffusione internazionale, come lo 078 e lo 018.
Una varietà di approcci di tipizzazione molecolare sono stati sviluppati per studiare il C. difficile e le CDI, tra cui: multilocus sequence typing (MLST), multilocus variable-number tandem-repeat analysis (MLVA), surface layer protein A gene sequence typing, amplificated fragment length polymorphism, elettroforesi su gel a campo pulsato (PFGE), analisi dell'endonucleasi di restrizione (REA), tossinotipizzazione (basata sui dati di sequenza delle tossine A e B) e ribotipizzazione PCR. Quando nel 2005, l'analisi molecolare ha portato all'identificazione di un tipo di ceppo di C. difficile caratterizzato come gruppo BI mediante analisi di endonucleasi di restrizione, NAP1 di tipo a campo pulsato nordamericano mediante elettroforesi su gel a campo pulsato e ribotipo 027 mediante ribotipizzazione PCR multiplex è stato chiamato C. difficile BI/NAP1/027. La diversa terminologia riflette le tecniche predominanti utilizzate per la tipizzazione epidemiologica, anche se la ribotipizzazione PCR è quella più ampiamente accettata in Europa dove l'Anaerobe Reference Laboratory di Cardiff (UK) tiene la collezione dei ceppi e assegna la numerazione dei ribotipi PCR. In Nord America, PFGE è il metodo di digitazione preferito.
Nel Nord America, a partire dal 2016, il ceppo NAP1 è stato sostituito da nuovi ceppi in alcune aree della British Columbia. Questi nuovi ceppi includono NAP2, NAP4, NAP9 e NAP11 e alcuni ceppi che non hanno una designazione NAP. La frequenza di questi nuovi ceppi è aumentata dal 2008 al 2013 in una regione studiata, sostituendo i batteri NAP1 originariamente più comuni e riconoscibili.
In generale, la maggior parte dei metodi di identificazione sono congruenti anche se non si ha una corrispondenza biunivoca tra le diverse tipizzazioni e solo le tecniche MLVA e REA consentono una sufficiente discriminazione tra diversi focolai.
I principali database dove sono registrate le caratterizzazioni genetiche dei diversi ceppi di C. difficile sono: Enterobase Public databases for molecular typing and microbial genome diversity (PubMLST).
Alcuni ceppi, ad esempio RT017 RT078 RT027, possono vivere con basse concentrazioni di zucchero trealosio; questi ceppi sono diventati più comuni dopo che il trealosio è stato introdotto come additivo alimentare nei primi anni 2000, aumentando così l'assunzione di cibi addizionati di trealosio.