Alto 208 cm per un peso di oltre 100 kg, era noto con il soprannome di Long John per la sua notevole statura. Professionista dal 2007 al 2023, ha vinto in carriera 16 titoli ATP in singolare, tra i quali spicca il Miami Open 2018, unico suo torneo Masters 1000. Il suo best ranking è stato l'8º posto in singolare raggiunto il 16 luglio 2018, anno in cui ha raggiunto la semifinale a Wimbledon. Si è distinto anche in doppio aggiudicandosi 8 tornei del circuito maggiore, tra i quali cinque Masters 1000, e raggiungendo la 14ª posizione mondiale nel luglio 2022. Al torneo di Wimbledon 2010, è stato protagonista e vincitore contro Nicolas Mahut del più lungo incontro di tennis della storia, durato 11 ore e 5 minuti.
Detiene il record di ace realizzati nel circuito maggiore (14.470), dopo aver superato il 1º luglio 2022 il precedente record di Ivo Karlovic ed essere diventato il primo tennista ad aver infranto la barriera dei 14.000 ace.
Nel 2016, in un match di primo turno di Coppa Davis, raggiunse i 253 km/h al servizio stabilendo il nuovo record di velocità alla battuta ufficialmente riconosciuto.
Carriera Tornei universitari e juniores Inizia a giocare a tennis a nove anni e si mette in luce per la prima volta come doppista nel 2002, arrivando alle finali di due importanti competizioni nazionali juniores. Nel 2003 diventa campione nazionale juniores in doppio mentre in singolare arriva ai quarti di finale. Quell'anno entra nell'Università della Georgia per la quale disputa quattro stagioni nei campionati di college della NCAA, ottenendo diversi trofei e riconoscimenti come doppista e singolarista a livello nazionale e regionale nella Southeastern Conference. In quegli anni matura dal punto di vista mentale e potenzia molto il fisico, aumentando il peso di 18 kg.
Nei quattro anni di università viene nominato quattro volte All-American, vince il titolo nazionale di college tre volte in doppio e una volta in singolare nel 2006, anno in cui per alcune settimane diventa il nº1 della NCAA. L'ultima stagione guida la squadra universitaria a vincere due prestigiosi titoli nazionali a squadre, che gli valgono la nomina a giocatore dell'anno e la 2ª posizione in classifica NCAA quando lascia il college nel giugno 2007 per diventare professionista. Porta a termine gli studi con la laurea in Scienze della Comunicazione.
Prime esperienze nei tornei professionistici Nell'aprile del 2003 fa la sua prima apparizione nel tabellone principale di un torneo professionistico del circuito ITF all'U.S.A. F9 di Elkin (Carolina del Nord), perdendo al primo turno in singolare e in doppio. A fine agosto debutta agli US Open con una sconfitta al primo turno nel torneo di doppio. Il 24 luglio 2005 vince il primo titolo ITF in doppio al torneo U.S.A. F18 di Joplin (Montana), arrivando ai quarti in singolare. A settembre debutta nel circuito Challenger a Lubbock e batte al primo turno Michael Russell prima di essere eliminato dal futuro vincitore del torneo Ramón Delgado. In questi anni arriva al massimo in 713ª posizione in singolare e alla 708ª in doppio del ranking ATP.
2007: prima finale ATP, primo trofeo Challenger e prime vittorie in incontri del Grande Slam Dopo avere terminato gli studi si dedica al professionismo, riparte dalla 839ª posizione del ranking e a inizio luglio del 2007 vince il primo torneo a cui partecipa al Futures U.S.A. F14. A fine mese conquista il primo titolo Challenger a Lexington superando in finale in tre set Brian Wilson. Subito dopo partecipa con una wild card al torneo ATP Legg Mason Tennis Classic di Washington e diventa il primo giocatore dell'era Open capace di vincere cinque partite consecutive al tie-break del set decisivo. Arriva in finale battendo nell'ordine Tim Henman, Benjamin Becker, Wayne Odesnik, il nº12 ATP Tommy Haas e in semifinale Gaël Monfils; perde quindi in due set la finale contro il nº5 del mondo Andy Roddick.
Con una nuova wild card debutta nelle Masters Series a Cincinnati perdendo al primo turno da David Ferrer, che lo supera anche al secondo turno a New Haven. All'esordio in singolare in un torneo del Grande Slam approda al terzo turno degli US Open e strappa il primo set al nº1 del mondo Roger Federer, che lo sconfigge con il punteggio di 7–6, 2–6, 4–6, 2–6. L'ultima parte della stagione gioca solo tornei Challenger nordamericani raggiungendo tre semifinali in singolare, che lo portano a fine anno al 106º posto mondiale, suo nuovo best ranking, con un balzo di 733 posizioni da luglio. Nello stesso periodo si aggiudica due tornei Challenger in doppio, raggiungendo a novembre la 220ª posizione ATP.
2008: top 100 All'inizio del 2008 debutta all'Australian Open e viene battuto al primo turno da Fabrice Santoro. Tre settimane dopo perde nei quarti al Pacific Coast Championships di San Jose da Florent Serra dopo avere superato ancora una volta Tommy Haas, risultato che gli permette di entrare tra i primi 100 del mondo. A marzo vince a Indian Wells il suo primo incontro in un Masters superando in tre set Simone Bolelli prima di arrendersi al nº4 ATP Nikolaj Davydenko. A fine maggio debutta al Roland Garros con una sconfitta in cinque set da Juan Ignacio Chela. Il mese dopo fa il suo esordio a Wimbledon raccogliendo un'altra sconfitta al primo turno. Dopo essere arrivato all'81º posto del ranking ad aprile, con la sconfitta nei quarti a Washington e quella al primo turno degli US Open si ritrova al 144º. Chiude la stagione nei Challenger americani vincendo quello di Lubbock.
I risultati più significativi in doppio del 2008 sono gli ottavi raggiunti al Roland Garros in coppia con Sam Querrey, il titolo ATP a luglio a Newport e i quarti al Cincinnati Masters con Mardy Fish, che gli consentono di entrare nei top 100 del ranking.
2009: top 40 A gennaio ad Auckland viene battuto nei quarti da Robin Söderling ed esce ancora al primo turno all'Australian Open, dove in coppia con Fish viene battuto nei quarti del torneo di doppio dai fratelli Bryan. A marzo supera per la prima volta un top 10 ATP sconfiggendo al secondo turno il nº9 Gaël Monfils, batte quindi Marat Safin prima di arrendersi con due tiebreak negli ottavi al nº6 Juan Martín del Potro. Raggiunge i quarti a Houston ad aprile e a maggio gli viene diagnosticata una mononucleosi che lo costringe a saltare il Roland Garros. Rientra dopo soli quaranta giorni e a luglio raggiunge nei tornei ATP la semifinale a Indianapolis e i quarti a Los Angeles. Viene eliminato in tre set da Roddick in semifinale al successivo torneo di Washington dopo avere superato al secondo turno il nº6 ATP Jo-Wilfried Tsonga.
Batte finalmente il nº5 ATP Roddick al terzo turno degli US Open dopo una partita equilibrata risoltasi al tiebreak del quinto set; al turno successivo si arrende al nº10 Fernando Verdasco. A fine torneo si trova al 39º posto in classifica, suo nuovo best ranking. Nonostante i modesti risultati di fine anno, conclude il 2009 al 34º posto ed è il terzo tennista statunitense alle spalle di Roddick e Sam Querrey. Scalzato dalla top 100 del doppio a luglio vi rientra a novembre grazie alla semifinale raggiunta a Vienna.
2010: primo titolo ATP, incontro più lungo nella storia del tennis e top 20
Isner inizia il 2010 vincendo al torneo di Auckland il suo primo titolo ATP in carriera battendo per 6–3, 5–7, 7–6 in finale Arnaud Clément. Vince il suo primo incontro in carriera all'Australian Open contro Andreas Seppi e viene eliminato negli ottavi da Andy Murray dopo avere superato Monfils. A febbraio perde in tre set la finale a Memphis contro Sam Querrey, assieme al quale vince il torneo di doppio. Il 5 marzo 2010 debutta in Coppa Davis superando in quattro set Victor Troicki nella sfida di Belgrado contro la Serbia valida per il primo turno del gruppo mondiale. Il giorno dopo vince in doppio in coppia con Bob Bryan e l'ultimo giorno viene battuto in cinque set dal nº2 ATP Novak Đoković; la Serbia si qualifica al secondo turno vincendo 3–2 e si aggiudicherà il trofeo per la prima volta sconfiggendo in finale la Francia. All'Indian Wells Masters esce negli ottavi per mano di Rafael Nadal e in semifinale nel doppio assieme a Querrey. Non va oltre il secondo turno in singolare alla sua prima esperienza agli Internazionali d'Italia, dove ancora in coppia con Querrey perde in semifinale dai fratelli Bryan. Subito dopo perde di nuovo da Querrey nella finale di Belgrado. Esce al terzo turno al Madrid Masters e al Roland Garros. A maggio migliora il best ranking in doppio salendo in 27ª posizione.
Diventa famoso anche per avere giocato e vinto a Wimbledon contro Nicolas Mahut il match più lungo della storia del tennis, iniziato il 22 giugno 2010 e terminato il 24 giugno dopo essere stato interrotto per due volte per oscurità. Si impone per 70 a 68 al quinto set dopo più di 11 ore di gioco. Il match supera i record stabiliti fino ad allora anche per il numero di game giocati e di ace serviti. Al secondo turno si arrende in tre set a Thiemo de Bakker e a fine torneo sale al 18º posto del ranking. Dopo tre settimane di riposo perde in finale contro Mardy Fish ad Atlanta, dove arriva in semifinale in doppio in coppia con James Blake. Agli US Open viene eliminato al terzo turno da Michail Južnyj e ad ottobre perde la semifinale a Pechino contro il nº2 ATP Đoković dopo essersi imposto nei quarti sul nº6 Nikolaj Davydenko. Negli ultimi tornei stagionali arriva ai quarti solo a Montpellier.
2011: due titoli ATP, quarti agli US Open e prima semifinale in un Masters 1000 Nella prima parte del 2011 non raccoglie grandi successi, dopo i quarti ad Auckland esce al terzo turno all'Australian Open. Ai Masters 1000 americani di marzo a Indian Wells e Miami arriva rispettivamente al terzo e al quarto turno. Ad aprile viene sconfitto in tre set in coppia con Querrey nella finale di doppio a Houston dai fratelli Bryan, identico risultato della semifinale al Madrid Masters. Sempre con Querrey si aggiudica il titolo di doppio agli Internazionali d'Italia approfittando del forfait in finale di Fish e Roddick. A maggio esce al primo turno del Roland Garros contro il nº1 del mondo Nadal facendosi rimontare un vantaggio di due set a uno; al torneo di Wimbledon viene eliminato al secondo turno.
Il 10 luglio vince il terzo titolo ATP in carriera a Newport superando Olivier Rochus in due set. Due settimane dopo perde in tre set la finale di Atlanta contro Mardy Fish. Ad agosto raggiunge la semifinale a Washington, non passa il secondo turno nei Masters 1000 di Montreal e Cincinnati e vince la finale a Winston-Salem contro Julien Benneteau, dopo avere sconfitto in semifinale Roddick. A settembre arriva per la prima volta ai quarti in una prova del Grande Slam agli US Open, venendo eliminato in quattro set da Andy Murray. Dopo una lunga pausa torna nel circuito uscendo al primo turno a Valencia. La settimana successiva perde contro Jo-Wilfried Tsonga la semifinale nel Masters 1000 di Parigi-Bercy, dopo avere superato nei quarti il nº5 David Ferrer.
2012: top 10, prima finale in un Masters 1000 e due titoli ATP