In biologia molecolare la trascrizione è il processo mediante il quale le informazioni contenute nel DNA vengono trascritte enzimaticamente in una molecola complementare di RNA. Concettualmente, si tratta del trasferimento dell'informazione genetica dal DNA all'RNA. Nel caso in cui il DNA codifichi una o più proteine, la trascrizione è l'inizio del processo che porta, attraverso la produzione intermedia di un mRNA, alla sintesi di peptidi o proteine funzionali.
La trascrizione presenta un meccanismo di controllo della fedeltà (o proofreading), ma esso è molto meno efficace di quelli legati alla replicazione del DNA; lo stesso meccanismo di sintesi dell'RNA, nel quale l'enzima RNA polimerasi ha un ruolo centrale, comporta un numero di errori decisamente maggiore.
Come per la replicazione del DNA, la trascrizione procede in direzione 5' → 3'. Più precisamente, il filamento lungo il quale il DNA viene scandito, detto filamento stampo, è percorso dall'enzima in direzione 3' → 5'. Il nuovo filamento di RNA, identico (a meno della ovvia differenza della pirimidina: presenta l'uracile anziché la timina) al filamento senso, viene sintetizzato a partire dal suo 5'.
Aspetti generali La trascrizione avviene attraverso particolari enzimi detti genericamente RNA polimerasi. Tali proteine sono spesso denominate RNA polimerasi DNA-dipendenti, dal momento che producono una molecola di RNA a partire da una di DNA. Tali enzimi utilizzano ribonucleosidi trifosfati (ovvero nucleotidi con tre gruppi fosfato) per formare l'RNA. Durante il processo, dai nucleosidi trifosfati vengono rimossi due gruppi fosfato per formare un legame covalente tra un nucleotide e quello successivo.
La RNA polimerasi si lega al DNA solo presso particolari sequenze, dette promotori, che non sono trascritte. Dal promotore iniziano a inserirsi i nucleotidi trifosfato per formare una sequenza di nucleotidi che sarà complementare al filamento di DNA in via di trascrizione. Dopo l'individuazione del promotore la RNA polimerasi rende il DNA adatto alla trascrizione. Il filamento di RNA inizia quindi ad allungarsi, attraverso l'aggiunta di un nucleotide per volta. Il primo nucleotide del neofilamento di RNA trattiene i tre gruppi fosfato mentre quelli successivi vengono privati di due gruppi fosfato attraverso una reazione esoergonica.
Quando, durante la trascrizione nel DNA, si incontrano particolari sequenze di basi (poste solitamente alla fine di ogni gene), la trascrizione termina.
Trascrizione nei procarioti Nei procarioti, la macchina trascrizionale è costituita dall'enzima multimerico RNA polimerasi, dal σ indispensabile per il riconoscimento del promotore e da eventuali altri fattori di trascrizione. L'assemblaggio di tutto il complesso di trascrizione basale segue delle fasi ben precise: tutto inizia dalla subunità α (alfa) che contatterà la subunità α2 (alfa2); tale dimero (o più correttamente eterodimero) ha già la capacità di legare il DNA anche se in maniera aspecifica; insieme promuovono l'assemblaggio del complesso. A questo punto si legano le subunità catalitiche β e β'; la subunità β' partecipa al legame aspecifico della polimerasi con il DNA, mentre la subunità β è la responsabile della vera e propria sintesi della molecola di RNA, che si formerà secondo lo schema di appaiamento citosina-guanina (C-G) e viceversa, timina-adenina (T-A) e adenina-uracile (A-U); il filamento di RNA infatti incorpora l'uracile al posto della timina.
Assemblaggio dell'oloenzima
L'RNA polimerasi, una volta formatasi, non è capace di riconoscere direttamente il promotore; per questo è necessaria la subunità σ (sigma), che prende parte nei più importanti processi di regolazione della trascrizione nei procarioti. Altro fondamentale fattore per l'assemblaggio è una proteina detta Catabolite Activating Protein (abbreviata come CAP o CRP), che legandosi nella sequenza consenso 35 nucleotidi a monte del sito di inizio (detta "sequenza -35", formata dalla sequenza TTGACA), fa assumere al promotore la corretta topologia affinché l'RNA polimerasi possa creare un legame stabile con il DNA. La CAP infatti interagisce con l'oloenzima sia a livello di σ sia a livello del dominio carbossi terminale di ὰ.
Dal complesso chiuso al complesso aperto
La CAP è legata alla sequenza consenso posta a -35 e ricca in AT e distorce il DNA. Anche grazie a questa distorsione δ contatta un'ampia regione del promotore in un modo tale da reclutare l'RNA polimerasi, che a questo punto comincia a fare le necessarie connessioni per la lettura del filamento senso (5'-> 3') e quindi sintetizzare l'ibrido DNA-RNA lungo 9-10 paia di basi. Ma l'evento che dà il via alla reazione deve essere la denaturazione locale del DNA a formare la cosiddetta bolla di trascrizione. In passato si pensava che ciò fosse indotto dalla particolare distorsione generata da tutti i fattori con cui il DNA interagisce, primo fra tutti CAP. In realtà l'apertura del DNA non avviene a -35 come ci si aspetterebbe vista la minore stabilità locale del DNA (ricco in quel punto di AT), ma più a valle a circa -10 (sequenza TATAAT detta "Pribnow box" o "TATA box"). Il segnale di apertura (melting del promotore) è indotto da un attivatore esterno capace di fosforilare la subunità ὰ2 nel dominio carbossiterminale (ὰ-CTD). Tale dominio si comporta come una sorta di pannello di controllo di tutta la trascrizione: il suo stato più o meno fosforilato infatti regola non solo la fase iniziale ma anche quella di allungamento e di terminazione.
Chiamato anche complesso Binario, binario perché formato dal DNA ed RNA polimerasi
Esso può essere chiuso o aperto
Chiuso: processo reversibile, la RNA polimerasi può staccarsi dal promotore, ma nei casi in cui ciò non avviene esso subisce una modifica conformazionale ovvero una isomerizzazione. Il legame ad H esistente fra A e T (adenina-timina) si spezza.La bolla di trascrizione si estende dalla sequenza -10 al +4.
Aperto: Per la formazione della bolla di trascrizione. A Questo punto la Rna polimerasi presenta nel sito attivo il primo nucleotide da trascrivere e da qui l'avvio della trascrizione.
Avvio della trascrizione
A questo punto la polimerasi può cominciare a leggere il DNA e ad appaiare le corrette basi azotate al fine di sintetizzare il trascritto primario (RNA non ancora processato). Questa fase della "messa a registro" è la più critica al punto che l'inizio della sintesi segue diversi inizi abortivi in cui l'RNA polimerasi non riesce a sintetizzare un filamento di RNA tanto lungo da fare cambiare conformazione a tutto il processo. È indispensabile infatti che avvenga un cambiamento conformazionale di tutto il complesso, il fattore σ che è servito a far riconoscere il promotore deve staccarsi, i legami che l'RNA polimerasi faceva con il DNA devono diventare aspecifici, così come CAP non è più necessaria. Probabilmente il tutto viene indotto dall'allungamento dell'ibrido RNA-DNA che nel momento in cui supera quelle 9-10 paia di basi crea un ingombro sterico tale da indurre il rilascio di tutti gli altri fattori.
Allungamento
Perché l'allungamento possa verificarsi il fattore σ deve lasciare l'RNA polimerasi, poiché aumentandone l'affinità per il promotore gli impedisce di allontanarsi da questo e di proseguire il suo cammino lungo il DNA da trascrivere. Questo è un momento delicato per tutto il processo e non sono rari inizi abortivi che si riferiscono all'abbandono della catena da parte dell'enzima entro l'aggiunta dei primi nove nucleotidi all'acido nascente. Terminati gli eventi abortivi, l'enzima perde i contatti dal -55 a -35 così l'enzima copre soltanto 50 basi. Quando la catena raggiunge 15-20 nucleotidi l'enzima compie un'altra transizione e forma il complesso di allungamento coprendo 30- 40 basi. Man mano che l'enzima procede nella trascrizione il DNA si deve svolgere più a valle e deve riavvolgersi a monte del sito di trascrizione, si forma così un tratto di circa 12 basi ibrido DNA- RNA. L'allungamento è in direzione 5'→ 3' grazie all'attacco nucleofilo da parte dell'estremità 3' -OH della catena neoformata verso il ribonucleotide trifosfato precursore che deve essere aggiunto, e più precisamente sul P in α liberando pirofosfato.
Terminazione
I segnali di terminazione sono nella sequenza di DNA, ma espletano la loro funzione solo quando sono trascritti in RNA. Essi possono indurre l'RNA di nuova sintesi ad assumere una struttura secondaria (generalmente delle forcine di terminazione) tale da destabilizzare e far staccare la Polimerasi, nel caso dei terminatori intragenici. La struttura a forcina si forma grazie all'elevata presenza di guanine e citosine che instaurano tra loro tre legami a idrogeno. Questa sequenza viene anche stabilizzata da legami a idrogeno dovuti ad appaiamenti non convenzionali. A valle della zona a forcina che si è formata si trova una sequenza di poliU: questo significa che sul DNA è presente una sequenza di poliA, e poiché l'appaiamento tra A e U è il più debole che si possa avere, il distacco dell'mRNA del DNA, e la conseguente terminazione della trascrizione viene favorita. Se il terminatore non è sufficientemente forte da promuovere da solo la terminazione, e questo può accadere quando non è presente la zona poliU, risulta essere necessaria una sequenza che ha un'alta affinità per la proteina RHO, un fattore di terminazione intergenica che stacca letteralmente dal complesso di trascrizione il trascritto primario. RHO si attacca all'mRNA in determinati punti che prendono il nome di RUT, RHO UTilization. Raggiunge la polimerasi e promuove il distacco del DNA quando la polimerasi si sofferma su un terminatore o quando i ribosomi si staccano per la presenza di un codone di terminazione e lasciano lo spazio necessario a RHO per legarsi all'mRNA.
Regolazione nei Procarioti
Livelli e meccanismi di regolazione
Quattro sono i livelli di regolazione nei procarioti: Scelta dei promotori da parte della subunità sigma dell'oloenzima Regolazione trascrizionale di primo livello (presenza o meno di impedimenti a monte del promotore = repressori, regolazione negativa) Regolazione trascrizionale di secondo livello (presenza o meno di attivatori, regolazione positiva) Regolazione co-trascrizionale (attenuazione)
Scelta dei promotori da parte della subunità sigma dell'RNA-polimerasi
La subunità sigma ha il compito di riconoscere sequenze di nucleotidi chiamate “consenso” in una regione di DNA compresa circa tra –70 e +30 rispetto all'inizio vero e proprio della trascrizione. Tale regione è detta Promotore. σ alternativi vengono di volta in volta sintetizzati ex novo o attivati attraverso modifiche conformazionali causate da particolari condizioni fisiche come stress metabolico o termico. Il primo esempio di geni attivati con questo meccanismo sono quelli che codificano le proteine da shock termico in questo caso si attiva il σ32 che permette all'RNA Polimerasi di riconoscere il promotore dei geni che codificano le proteine Hsp. Oltre alla subunità sigma, che riconosce due specifiche sequenze consenso a circa –10 (TATAAT, TATA box) e –35 (TTGACA); per alcuni geni anche le subunità alfa possono interagire con una regione di promotore chiamata elemento UP (Upstream Promoter) ricco di AT presente tra –60 e –40. La velocità e la processività con cui la RNA polimerasi trascriverà il gene successivo al promotore dipende dalla minore o maggiore coincidenza delle sequenze reali con quelle "ottimali" descritte sopra.
Regolazione trascrizionale di primo livello
Di seguito o nelle vicinanze del promotore possono essere presenti siti a cui si legano repressori proteici, dunque anche se il promotore permettesse l'attacco della RNA-polimerasi, essa non potrà agire finché il repressore non viene rimosso dalla doppia elica a seguito del legame con molecole specifiche. Tale meccanismo è detto Regolazione negativa.
Regolazione trascrizionale di secondo livello