In biologia molecolare, la replicazione del DNA è il processo di produzione di due repliche di una molecola di DNA identiche all'originale. Questo processo si verifica in tutti gli organismi viventi e in alcuni virus ed è alla base dell'ereditarietà genetica.
Il DNA è costituito da una doppia elica di due filamenti complementari. Durante la replicazione, i due filamenti si separano e ognuno funge da modello per la produzione della sua copia, un processo denominato replicazione semiconservativa. Come risultato, le due nuove molecole saranno composte da un filamento di DNA originale e dal suo complementare di nuova sintesi. Meccanismi di correzione di bozze e meccanismi di controllo degli errori garantiscono una fedeltà quasi perfetta del processo di replicazione.
In una cellula, la replicazione del DNA ha inizio in punti specifici (o origini della replicazione) nel genoma. Lo srotolamento del DNA all'origine e la sintesi di nuovi filamenti, adattati da un enzima noto come elicasi, determinano la crescita delle forcelle di replicazione bi-direzionali dall'origine. Un certo numero di proteine è associato alla forcella di replicazione per l'iniziazione e la continuazione della sintesi del DNA; la più importante, la DNA polimerasi, sintetizza i nuovi fili aggiungendo nucleotidi alla catena. La replicazione del DNA si verifica durante lo stadio S dell'interfase.
La replicazione del DNA (amplificazione del DNA) può anche essere eseguita in vitro, dove le DNA polimerasi isolate dalle cellule e i primer del DNA artificiale possono essere utilizzati per iniziare la sintesi del DNA in sequenze note di una molecola di DNA modello. Esempi sono la reazione a catena della polimerasi (PCR), la reazione a catena della ligasi (LCR) e l'amplificazione mediata da trascrizione (TMA).
Struttura del DNA
Il DNA esiste come una struttura a doppio filamento, con entrambi i filamenti arrotolati insieme per formare la caratteristica doppia elica. Ogni singolo filamento di DNA è una catena di quattro tipi di nucleotidi. I nucleotidi nel DNA contengono uno zucchero (il desossiribosio), un fosfato e una base azotata. I quattro tipi di nucleotide corrispondono alle quattro basi azotate adenina, citosina, guanina e timina, comunemente abbreviate come A, C, G e T. Adenina e guanina sono basi purine, mentre citosina e timina sono pirimidine. Questi nucleotidi formano legami fosfodiestere, creando la spina dorsale fosfato-desossiribosio della doppia elica del DNA con le basi azotate rivolte verso l'interno (cioè verso il filo opposto). Le basi azotate di un filamento sono accoppiate a quelle dell'altro attraverso legami a idrogeno. L'adenina si accoppia con la timina (due legami a idrogeno) e la guanina si accoppia con la citosina (tre legami a idrogeno).
I filamenti di DNA hanno una direzionalità e le diverse estremità di un singolo filamento sono chiamate 3 (tre-primo) e 5 (cinque-primo). Per convenzione, se viene fornita la sequenza di base di un singolo filamento di DNA, l'estremità sinistra della sequenza è l'estremità 5 ', mentre l'estremità destra della sequenza è l'estremità 3'. I trefoli della doppia elica sono anti-paralleli con uno da 5 'a 3', e il filo opposto da 3 'a 5'. Questi termini si riferiscono all'atomo di carbonio del desossiribosio a cui si lega il prossimo fosfato nella catena. La direzionalità ha conseguenze nella sintesi del DNA, poiché la DNA polimerasi può sintetizzare il DNA in una sola direzione aggiungendo nucleotidi all'estremità 3 di un filamento di DNA.
L'accoppiamento di basi complementari nel DNA (attraverso il legame a idrogeno) significa che le informazioni contenute all'interno di ciascuna sezione sono ridondanti. I legami fosfodiesterici (all'interno di un filamento) sono più forti dei legami di idrogeno (tra le basi azotate dei due filamenti). Ciò consente ai fili di essere separati l'uno dall'altro. I nucleotidi di un singolo filamento possono quindi essere usati per sintetizzare univocamente un filamento complementare.
Enzimi della replicazione del DNA
Sulla forcella di replicazione, molti enzimi di replicazione si assemblano sul DNA in una complessa macchina molecolare chiamata replisoma. Di seguito è riportato un elenco delle principali enzimi di replicazione del DNA che partecipano al replisoma:
Elicasi del DNA: Anche nota come enzima destabilizzante dell'elica. L'elicasi separa i due filamenti di DNA creando la forcella di replicazione dietro la topoisomerasi. RNA primasi: deposita una sequenza di RNA dette (primer) da cui poi il DNA polimerasi inizierà la sintesi. DNA polimerasi: L'enzima responsabile della catalisi dell'aggiunta di substrati nucleotidici al DNA nella direzione 5′ a 3′ durante la replicazione del DNA. Esegue anche la correzione degli errori. Morsetto del DNA: Una proteina che impedisce alle DNA polimerasi in allungamento di dissociarsi dal filamento genitore del DNA. Proteina legante il DNA a singolo filamento: Si legano al ssDNA e impediscono al doppio elica del DNA di ri-annealarsi dopo che l'elicasi del DNA lo svolge. Topoisomerasi: Rilassa il DNA dalla sua natura super-avvolta. DNA girasi: Allevia la tensione dello svolgimento da parte dell'elicasi del DNA; questo è un tipo specifico di topoisomerasi. DNA ligasi: Ri-anneala i filamenti semi-conservativi e unisce i frammenti di Okazaki del filamento ritardato. Telomerasi: Allunga il DNA telomerico aggiungendo sequenze nucleotidiche ripetitive alle estremità dei cromosomi eucariotici.
DNA polimerasi
Le DNA polimerasi sono una famiglia di enzimi che svolgono tutte le forme di replicazione del DNA. Le DNA polimerasi in generale non possono incominciare la sintesi di nuovi filamenti, ma possono estendere solo un filamento di DNA o RNA esistente abbinato a un filo modello. Per iniziare la sintesi, un breve frammento di RNA, chiamato primer, deve essere creato e abbinato al filamento del DNA modello.
La DNA polimerasi aggiunge un nuovo filamento di DNA estendendo l'estremità di 3' di una catena nucleotidica esistente, aggiungendo nuovi nucleotidi abbinati al filamento del modello uno alla volta attraverso la creazione di legami fosfodiesterici. L'energia per questo processo di polimerizzazione del DNA deriva dall'idrolisi dei legami di fosfato ad alta energia (fosfoanidride) tra i tre fosfati attaccati a ogni base non incorporata. Basi libere con il loro fosfato attaccato a ogni base non incorporata. Le basi libere con i gruppi di fosfati collegati sono chiamate nucleotidi; in particolare, le basi con tre gruppi di fosfati collegati sono chiamate nucleosidi trifosfati. Quando un nucleotide viene aggiunto a un filamento di DNA in crescita, la formazione di un legame fosfodiestere tra il fosfato prossimale del nucleotide e la catena di crescita è accompagnata dall'idrolisi di un legame fosfato ad alta energia con rilascio dei due fosfati distali come pirofosfato. L'idrolisi enzimatica del pirofosfato risultante in fosfato inorganico consuma un secondo legame fosfato ad alta energia e rende la reazione effettivamente irreversibile.
In generale, le DNA polimerasi sono altamente accurate, con un tasso di errore intrinseco inferiore a un errore ogni 107 nucleotidi aggiunti. Inoltre, alcune DNA polimerasi hanno anche la capacità di correzione; possono rimuovere i nucleotidi dall'estremità di un filamento in crescita per correggere le basi non corrispondenti. Infine, i meccanismi di riparazione post-replicazione mismatch monitorano il DNA alla ricerca di errori, essendo in grado di distinguere le discrepanze nel filamento di DNA appena sintetizzato dalla sequenza originale del filamento. Insieme, queste tre fasi di discriminazione consentono una fedeltà di replicazione di meno di un errore per ogni 109 nucleotidi aggiunti.
Il tasso di replicazione del DNA in una cellula vivente è stato inizialmente misurato come il tasso di allungamento del DNA T4 del fago in E. coli infetto da fago. Durante il periodo di aumento esponenziale del DNA a 37 °C, il tasso era di 749 nucleotidi al secondo. Il tasso di mutazione per coppia di base per replicazione durante la sintesi del DNA di fago T4 è di 1.7 per 108.
Il processo di replicazione
La replicazione del DNA è un processo definito semiconservativo, in cui da ciascuno dei due filamenti della molecola originaria, detti "parentali", se ne origina un altro detto "di neo sintesi", in modo che le due molecole risultanti sono composte da un filamento vecchio e uno nuovo. Il processo avviene in tre fasi catalizzate enzimaticamente e coordinate: inizio, allungamento e fine.
Inizio
Perché una cellula possa dividersi, deve prima replicare il suo DNA. Questo processo viene avviato in particolari punti del DNA, noti come "origini", che vengono presi di mira dalle proteine iniziatrici. In E. coli questa proteina è DNA; nel lievito, questo è il complesso di riconoscimento dell'origine. Le sequenze utilizzate dalle proteine iniziatrici tendono a essere "AT-ricche" (ricche di basi adenina e timina), perché le coppie di basi A-T hanno due legami idrogeno (piuttosto che i tre formati in una coppia C-G) e sono quindi più facili da separare. Una volta individuata l'origine, questi iniziatori reclutano altre proteine e formano il complesso pre-replicazione, che svolge il DNA a doppio filamento.
Allungamento
La DNA polimerasi ha un'attività di 5′-3′. Tutti i sistemi noti di replicazione del DNA richiedono un gruppo ossidrilico libero da 3' prima che la sintesi possa essere avviata (nota: il modello di DNA viene letto in una direzione da 3′ a 5′, mentre un nuovo filamento viene sintetizzato nella direzione da 5′ a 3′ - questo è spesso confuso). Sono riconosciuti quattro meccanismi distinti per la sintesi del DNA: Tutte le forme di vita cellulari e molti virus del DNA, fagi e plasmidi usano una primasi per sintetizzare un breve primer RNA con un gruppo libero 3′ OH che viene successivamente allungato da una DNA polimerasi. I retroelementi (compresi i retrovirus) impiegano un RNA di trasferimento come primer di replicazione fornendo un 3′ OH libero, utilizzato per l'allungamento da parte della trascrittasi inversa. Negli adenovirus e nella famiglia dei batteriofagi φ29, il gruppo 3' OH è fornito dalla catena laterale di un aminoacido della proteina attaccata al genoma (la proteina terminale) a cui i nucleotidi sono aggiunti dalla DNA polimerasi per formare un nuovo filamento. Nei virus del DNA a singolo filamento - un gruppo che comprende i circoviri, i geminivirus, i parvovirus e altri - e anche i molti fagi e plasmidi che utilizzano il meccanismo di replicazione del cerchio rotante (RCR), l'endonucleasi RCR crea un nick nel filamento del genoma (virus a singolo filamento) o uno dei filamenti del DNA (plasmidi). L'estremità 5′ del filamento scalfito viene trasferita a un residuo di tirosina sulla nucleasi e il gruppo libero 3′ OH viene poi utilizzato dalla DNA polimerasi per sintetizzare il nuovo filamento.
Il primo è il più noto di questi meccanismi è utilizzato dagli organismi cellulari. In questo meccanismo, una volta che i due filamenti sono separati, la primasi aggiunge primer RNA ai filamenti modello. Il filamento principale riceve un primer RNA mentre il filamento in ritardo ne riceve diversi. Il filamento principale è continuamente esteso dal primer da una DNA polimerasi ad alta processività, mentre il filamento in ritardo è esteso in modo discontinuo da ogni primer formando frammenti di Okazaki. La RNAsi rimuove i frammenti di RNA del primer, e una DNA polimerasi a bassa processività distinta dalla polimerasi replicativa entra per colmare le lacune. Quando questo processo è completo, si può trovare una singola intaccatura sul filamento principale e diverse intaccature sul filamento in ritardo. La ligasi lavora per riempire queste intaccature, completando così la nuova molecola di DNA replicata.