Геномска библиотека ― збирка од преклопени фрагменти на ДНК кои заедно ја сочинуваат вкупната геномска ДНК на еден организам. ДНК е складирана во состав од идентични вектори, од кои секој содржи различен додаток на ДНК. Со цел да биде изградена геномска библиотека, ДНК на организмот е извлекуван од клетките и потоа е варен со рестрикционен ензим за да биде исечена ДНК-та во фрагменти со одредена големина. Фрагментите потоа се вметнувани во векторот користејќи ДНК-лигаза. Следно, векторската ДНК може да биде преземена од организам-домаќин - најчесто население на Escherichia coli или квасец - при што секоја клетка содржи само една векторска молекула. Користењето на клетка-домаќин за носење на векторот овозможува лесно засилување и пронаоѓање на специфични клонови од библиотеката за анализа.
Достапни се неколку видови вектори со различни капацитети на вметнување. Општо земено, библиотеките направени од организми со поголеми геноми бараат вектори со поголеми внесови, а со тоа се потребни помалку векторски молекули за да биде направена библиотеката. Истражувачите можат да изберат вектор, исто така, земајќи ја предвид идеалната големина на внесот за да го најдат саканиот број на клонови неопходни за целосна покриеност на геномот.
Геномските библиотеки најчесто се користени за секвенционирачки примени. Тие одиграле важна улога во целокупното секвенционирање на геномот на неколку организми, вклучувајќи го и човечкиот геном и неколку моделни организми.
Историја Првиот геном заснован на ДНК некогаш целосно секвенциониран бил постигнат од двократниот добитник на Нобеловата награда, Фредерик Сенгер, во 1977 година. Сенгер и неговата група научници создале библиотека на бактериофагот, phi X 174, за употреба во секвенционирањето на ДНК. Важноста на овој успех придонесе за постојано зголемување на побарувачката за секвенционирање на геномите за истражување на генската терапија. Научниците сега можат да ги каталогизираат полиморфизмите во геномите и да ги истражат оние кандидатски гени кои придонесуваат за болести како Паркинсонова болест, Алцхајмерова болест, мултипла склероза, ревматоиден артритис и дијабетес тип 1. Овие се должат на напредокот на општогеномските студии за поврзување од способноста да бидат создавани и секвенционирани геномски библиотеки. Претходните студии за поврзување и кандидатски гени биле некои од единствените пристапи.
Изградба на геномска библиотека Изградбата на геномска библиотека вклучува создавање на многу рекомбинантни молекули на ДНК. Геномската ДНК на организмот е екстрахирана и потоа е варена со рестрикционен ензим. За организми со многу мали геноми (~10 kb), сварените фрагменти може да бидат одвоени со гелна електрофореза. Одделените фрагменти потоа може да бидат исечени и клонирани во векторот посебно. Меѓутоа, кога голем геном е варен со рестрикционен ензим, има премногу фрагменти за поединечно акцизирање. Целиот сет на фрагменти мора да биде клониран заедно со векторот, а потоа може да дојде до раздвојување на клоновите. Во секој случај, фрагментите се врзувани во вектор кој е варен со истиот рестрикционен ензим. Векторот што ги содржи вметнати фрагменти од геномската ДНК потоа може да биде внесен во организмот-домаќин.
Подолу се чекорите за создавање геномска библиотека од голем геном:
Екстрактирање и прочистување на ДНК. Варење на ДНК со рестрикционен ензим. Ова создава фрагменти кои се слични по големина, а секој содржи еден или повеќе гени. Вметнете ги фрагментите од ДНК во вектори кои се исечени со истиот рестрикционен ензим. Користење на ензимот за ДНК-лигаза за да ги запечати фрагментите на ДНК во векторот. Ова создава голем фонд на рекомбинантни молекули. Овие рекомбинантни молекули ги презема бактеријата домаќин со преобразба, создавајќи библиотека на ДНК.
Подолу е дијаграм на горенаведените чекори. мини|500x500пкс| Изградба на геномска библиотека.
Одредување на титарот на библиотеката Откако ќе биде изградена геномска библиотека со вирусен вектор, како што е ламбда фагот, може да биде одреден титарот на библиотеката. Пресметувањето на титарот им овозможува на истражувачите приближно да утврдат колку заразни вирусни честички биле успешно создадени во библиотеката. За да биде сторено ова, разредувањата на библиотеката се користени за преобразба на културата E. coli со познати концентрации. Културите потоа се ставани на агарни плочи и се инкубирани преку ноќ. Бројот на вирусни плочи е броен и може да биде користен за пресметување на вкупниот број на заразни вирусни честички во библиотеката. Повеќето вирусни вектори исто така носат маркер кој овозможува клоновите што содржат внес да се разликуваат од оние што немаат внес. Ова им овозможува на истражувачите да го одредат и процентот на заразни вирусни честички кои всушност носат фрагмент од библиотеката.
Сличен метод може да биде користен за титрирање на геномски библиотеки направени со невирусни вектори, како што се плазмиди и бактерискиот вештачки хромозом. Пробнаталигација на библиотеката може да биде користена за да ја преобрази E. coli. Преобразбата потоа се шири на агарни плочи и се инкубира преку ноќ. Титарот на преобразбата е одредуван со броење на бројот на колонии присутни на плочите. Овие вектори претежно имаат изборен маркер што овозможува диференцијација на клоновите што содржат вметнување од оние што не содржат. Со правење на овој тест, истражувачите исто така можат да ја одредат ефикасноста на лигацијата и да направат прилагодувања по потреба за да бидат осигурани дека ќе го добијат саканиот број на клонови за библиотеката.
Библиотека за прегледување лево|мини|500x500пкс| Хибридизација на размачкана колонија. За да бидат изолирани клоновите што содржат региони од интерес од библиотеката, библиотеката мора прво да биде проверена. Еден метод на преглед е хибридизација. Секоја преобразена клетка-домаќин на библиотеката ќе содржи само еден вектор со еден внес на ДНК. Целата библиотека може да биде поставена на филтер преку медиум. Филтерот и колониите се подготвувани за хибридизација и потоа се означувани со сонда. Целниот внес на ДНК од интерес, може да биде идентификуван со откривање како што е авторадиографија поради хибридизацијата со сондата како што е прикажано подолу.
Друг метод на преглед е со полимеразна верижна реакција. Некои библиотеки се чувани како фондови на клонови и прегледот со полимеразна верижна реакција е ефикасен начин да бидат идентификувани фондови кои содржат специфични клонови.
Видови вектори Големината на геномот варира кај различни организми и векторот за клонирање мора да биде избран соодветно. За голем геном, треба да биде избере вектор со голем капацитет така што релативно мал број клонови се доволни за покривање на целиот геном. Сепак, често е потешко да биде карактеризиран внесот содржан во вектор со поголем капацитет.
Подолу е табела со неколку видови вектори кои вообичаено се користени за геномски библиотеки и големината на внесот што претежно ја поседува секој. Векторски вид Големина на внес (илјада основи) Плазмиди до 10 Фаг ламбда (λ) до 25 Космиди до 45 Бактериофаг P1 70 до 100 P1 вештачки хромозоми 130 до 150 Бактериски вештачки хромозоми 120 до 300 Квасни вештачки хромозоми 250 до 2000
Плазмиди Плазмидот е двоверижна кружна молекула на ДНК која најчесто е користена за молекуларно клонирање. Плазмидите обично се со должина од 2 до 4 килобазни парови (kb) и се способни да носат внесови до 15 kb. Плазмидите содржат потекло на репликација што им овозможува да се реплицираат внатре во бактеријата независно од хромозомот-домаќин. Плазмидите најчесто носат ген за отпорност на антибиотици што овозможува избор на бактериски клетки кои го содржат плазмидот. Многу плазмиди исто така носат известувачки ген кој им овозможува на истражувачите да ги разликуваат клоновите што содржат вметнување од оние што не содржат.
Фаг ламбда (λ) Фагот λ е двоверижен вирус на ДНК кој ја заразува E. coli. Хромозомот на ламбдата е долг 48,5 kb и може да носи внесови до 25 kb. Овие внесови ги заменуваат несуштинските вирусни низи во хромозомот на ламбдата, додека гените потребни за создавање вирусни честички и инфекција остануваат недопрени. Вметната ДНК се реплицира со вирусната ДНК; така, заедно се пакуваат во вирусни честички. Овие честички се многу ефикасни при инфекција и размножување што доведува до поголемо производство на рекомбинантните хромозоми на ламбда. Сепак, поради помалата големина на внесот, библиотеките направени со ламбда фаг може да бараат многу клонови за целосна покриеност на геномот.
Космиди Космидните вектори се плазмиди кои содржат мал регион на ДНК на бактериофагот ламбда наречена cos-низа. Оваа низа овозможува космидот да биде пакуван во честички на ламбда бактериофагот. Овие честички - кои содржат линеаризиран космид - се внесувани во клетката-домаќин со трансдукција. Откако ќе влезат во домаќинот, космидите кружат со помош на ДНК-лигазата на домаќинот и потоа функционираат како плазмиди. Космидите се способни да носат внесови со големина до 40 kb.
Вектори на бактериофаг P1 Векторите на бактериофагот P1 можат да носат внесови со големина од 70 – 100 kb. Тие започнуваат како линеарни молекули на ДНК спакувани во честички од бактериофагот P1. Овие честички се вбризгувани во сој на E. coli што изразува кре рекомбиназа. Линеарниот P1 вектор станува кружен со рекомбинација помеѓу две loxP места во векторот. P1 векторите претежно содржат ген за отпорност на антибиотици и позитивен маркер за одбирање за да бидат разликувани клоновите што содржат внес од оние што не содржат. Векторите P1, исто така, содржат плазмиден репликон P1, кој гарантира дека само една копија од векторот е присутна во клетката. Сепак, постои втор P1 репликон - наречен P1 литички репликон - кој е контролиран од индуциран промотор. Овој промотор овозможува засилување на повеќе од една копија на векторот по клетка пред екстракција на ДНК. десно|мини|400x400пкс| Вектор на бактериски вештачки хромозом.
P1 вештачки хромозоми P1 вештачките хромозоми имаат особина и на P1 вектори и на бактериските вештачки хромозоми. Слично на векторите P1, тие содржат плазмид и литички репликон како што е опишано погоре. За разлика од векторите P1, тие не треба да бидат пакуваани во бактериофаготни честички за трансдукција. Наместо тоа, тие се внесувани во E. coli како кружни молекули на ДНК преку електропорација исто како што се бактериските вештачки хромозоми. Исто така слични на бактериските вештачки хромозоми, тие се релативно потешко да бидат подготвени поради едно единствено потекло на репликација.
Бактериски вештачки хромозоми Бактериските вештачки хромозоми се кружни молекули на ДНК, обично со должина од околу 7 kb, кои се способни да држат внесови со големина до 300 kb. Векторите на бактериските вештачки хромозоми содржат репликон изведен од факторот F на E. coli, кој гарантира дека тие се одржувани на една копија по клетка. Штом внесот ќе биде поврзан во бактериски вештачки хромозом, бактерискиот вештачки хромозом е внесуван во соеви со недостаток на рекомбинација на E. coli со електропорација. Повеќето вектори на бактериски вештачки хромозом содржат ген за отпорност на антибиотици и исто така позитивен маркер за одбирање. Сликата десно прикажува вектор на бактериски вештачки хромозом, кој е сечен со рестрикционен ензим, проследено со вметнување на туѓа ДНК која повторно е анелирано со лигаза. Претежно, ова е многу стабилен вектор, но можеби е тешко да бидат подготвени поради едно единствено потекло на репликација исто како и P1 вештачките хромозоми.
Квасни вештачки хромозоми