Microssatélites são unidades de repetição de pares de bases do ADN (AT, GC), que são utilizados como marcador genético em estudos de parentesco, as migrações humanas e de origem humana. Os microssatélites apresentam taxas mais altas de mutação genética em relação a outras partes do ADN e, portanto, perfeito para estudar ancestralidade humana. Eles são basicamente loci polimórficos presentes no ADN nuclear e ADN organela que consistem em unidades repetitivas 3-7 bases de comprimento.
O conceito de marcadores está intimamente ligado à incapacidade humana de definir, com precisão, os fatores genéticos que governam as características fenotípicas de seu interesse. É prática comum no melhoramento genético de plantas e animais tentar identificar caracteres facilmente detectáveis, como cor de flor, que estejam fortemente correlacionados com uma característica de difícil mensuração, como a resistência a determinada doença. Se a associação, de fato, existe, o caráter qualitativo é um marcador fenotípico ligado à resistência. Neste caso, é muito provável que pelo menos um gene, que determine o caráter qualitativo esteja localizado no mesmo grupo de ligação dos genes que governam a resistência. Partindo desse princípio, qualquer fragmento de ADN próximo ao gene de resistência poderia ser utilizado como marcador, que neste caso é denominado marcador molecular. A grande vantagem dos marcadores moleculares de ADN, com relação a outros tipos de marcadores é a sua abundância, a sua insensibilidade aos fatores do ambiente e o fato de o ADN estar presente em todas as células do organismo.Miesfeld, R., Krystal, M. & Arnheim, N. A member of a new repeated sequence family which is conserved throughout eucaryotic evolution is found between the human δ- and β-globin genes. Nucleic Acids Res. 9, 5931–5947 (1981). thumb|200px|Termociclador, Aparelho utilizado para realizar uma PCR.
Definição de microssatélites Diferentes experimentos no início dos anos 80 demonstraram que,os genomas eucariotas são densamente povoados por diferentes classes de sequências repetidas, umas mais complexas (minisatélites) e outras mais simples. Sequências simples repetidas (“SSR-Simple Sequence Repeats”), mais tarde denominadas também de microsatélites, consistem de pequenas sequências (“sequence motif”) com 1 a 4 nucleotídeos de comprimento, repetidas em tandem. Em genomas de eucariotos, estas sequências simples são mais freqüentes, melhor distribuídas ao acaso e formam locos hipervariáveis constituídos por minisatélites.Levinson, G. & Gutman, G. A. High frequencies of short frameshifts in poly-CA/TG tandem repeats borne by bacteriophage M13 in Escherichia coli K-12. Nucleic Acids Res. 15, 5323–5338 (1987). Este loco altamente polimórfico, amplificado via PCR foi também denominado de “STMS- Sequence Tagged Microsatellite Sites”, ou seja, sítios de microssatélies marcados por sequência,e constituem a classe mais polimórfica de marcadores moleculares disponíveis hoje.O acrônimo SSRP (Simple Sequence Repeat Polymorphism) também é comumente encontrado em literatura. Microsatélites têm sido observados em diversos organismos, como em seres humanos, baleias, Drosophila , camundongos , bovinos e caprinos , espécies vegetais, entre outros. Em plantas, a sua existência já havia sido sugerida, com a observação de que oligonucleotídeos contendo elementos repetidos de TG e GATA/GACA detectam polimorfismo, quando utilizados como sondas RFLP. Os elementos repetidos mais freqüentes em mamíferos são extensos de di-nucleotídeos CA e TG. Em plantas, uma busca em bancos de dados de sequências de ADN publicadas revelou que sítios de microsatélites são largamente distribuídos com uma freqüência de um a cada 50 mil pares de bases. Sua presença foi constatada em 34 espécies vegetais, sendo que o alimento repetido mais comum foi o di-nucleotídeo AT claramente documentaram a presença de sequências simples repetidas em plantas pela primeira vez. O experimento surpreendentemente incluiu 5 espécies arbóreas tropicais, além de milho. Marcadores baseados em microsatélites estão, atualmente, sendo desenvolvidos para aplicações de mapeamento genético para algumas culturas anuais de maior expressão tais como soja, arroz e trigo bem como, para arbóreas florestais como Pinus e frutíferas como Citrus.
Aplicações Os marcadores moleculares são utilizados em investigações genéticas com diversas finalidades, como por exemplo, na identificação de clones, linhagens, híbridos, cultivares, paternidade, estimativas de diversidade, fluxo gênico, taxa de cruzamento, parentesco e na construção de mapas genéticos. Marcadores permitiram identificar espécies, independente do estado de vida do animal. Os microssatélites são essenciais marcadores na seleção de animais, vegetais, bactérias, dentre outros e estão amplamente distribuídos pelos cromossomos do genoma. A utilidade destes marcadores agrupados aos avanços na biotecnologia de reprodução possibilita perspectivas promissoras no melhoramento animal, vegetal e outros, devido à elevação da intensidade e precisão da escolha e na diminuição do intervalo entre gerações. Os microssatélites tem outras aplicações como por exemplo: grau de estruturação de populações, a freqüência de fenômenos migratórios, o fluxo de genes, o afunilamento demográfico, a redução do tamanho efetivo de uma população, a diagnose de hibridismo e as aplicações forenses como o rastreio de abates ilegais.CAMINHAS, M.M.T.; BERTOLOZZI, J.; CHAMMA, O.S.; CURI, P.R. Grupos sanguineos de bovinos. Pesquisa Agropecuária Brasileira, v.27, n.8, p.1195-1200, 1992.
Histórico 1981 - Análise da sequência de alelos no lócus da globina encontrado um número variável de sequências curtas. 1982 - Identificação de um seqüenciamento alternado pirimidina purina (polímeros em genomas eucarióticos). 1985 - Demonstração de extensa variabilidade da duração do tandem ADN repetitivo como revelado pela ADN de minisatélites. 1986 - Regiões da “simplicidade enzimática” identificado como uma importante fonte de variação genética. 1989 - Desenvolvimento de PCR baseados na extração de microssátélites. 1991 - Microssatélites introduzidos para estudos dos recursos naturais populacionais. 1992 - Microssatélites utilizados para derivar a primeira análise detalhada no mapa genômico do ser humano. 1993 - Um grande número de microssatélites com mutações identificadas em análises de pedigree em humanos. 1994 - Análise de escalas das reações entre possíveis populações humanas feitas por micossatélites.
Marcadores baseados na amplificação de microsatélites Diferentes experimentos no início dos anos 80 demonstraram que os genomas eucariotos são densamente povoados por diferentes classes de sequências repetidas, umas mais complexas (minisatélites) e outras mais simples. Sequências simples repetidas (“SSR-Simple Sequence Repeats”), mais tarde denominadas também de microsatélite, consistem de pequenas sequências (“sequence motif) com 1 a 4 nucleotídeos de comprimento, repetidas em tandem. Em genomas de eucariotos, estas sequências simples são mais freqüentes, melhor distribuídas ao acaso e formam locos hipervariáveis constituídos por minisatélites. Este loco altamente polimórfico, amplificado via PCR foram também denominados de “STMS- Sequence Tagged Microsatellite”, ou seja, sítios de microsatélies marcados por sequência, e constituem a classe mais polimórfica de marcadores moleculares disponíveis hoje. O acrônimo SSRP (Simple Sequence Repeat Polymorphism) também é comumente encontrado em literatura.Zayed A, Packer L, Grixti JC et al. (2005) Increased genetic differentiation in a specialist versus a generalist bee: implications for conservation. Conservation Genetics, 6, 1017–1026. Microsatélites têm sido observados em diversos organismos como em seres humanos baleias, Drosophila , camundongos , bovinos e caprinos ,entre outros. Em plantas, a sua existência já havia sido sugerida com a observação de que oligonucleotídeos contendo elementos repetidos de TG e GATA/GACA detectam polimorfismo quando utilizados como sondas RFLP. Os elementos repetidos mais frequentes em mamíferos são extensos de di-nucleotídeos CA e TG . Em plantas, uma busca em bancos de dados de sequências de ADN publicadas revelou que sítios de microsatélites são largamente distribuídos com uma freqüência de um a cada 50 mil pares de bases. Sua presença foi constatada em 34 espécies vegetais, sendo que o alimento repetido mais comum foi o di-nucleotídeo AT claramente documentaram a presença de sequências simples repetidas em plantas pela primeira vez.O experimento surpreendentemente incluiu 5 espécies arbóreas tropicais além de milho. Marcadores baseados em microsatélites estão atualmente sendo desenvolvidos para aplicações de mapeamento genético para algumas culturas anuais de maior expressão tais como soja, arroz e trigo bem como, para arbóreas florestais como Pinus e frutíferas como Citrus.BEIGUELMAN,B. A lei Hardy e Weinberg. In:BEIGUELMAN,B.Dominância dos genes nas famílias e nas populações.2.ed. Ribeirão Preto: SBG,1995.cap.7,p.179 202. thumb|Os microsatélites tem uma vasta utilidade.
Base genética e detecção de marcadores microsatélites Regiões contendo sequências simples repetidas são amplificadas individualmente através de PCR utilizando-se um par “primers” específicos (de 20 a 30 bases) complementares a sequências únicas que flanqueiam e microsatélite. Segmentos amplificados a partir desses sítios quase que invariavelmente apresentam um polimorfismo extensivo, resultante da presença de diferentes números de elementos simples repetidos. Assim, cada “ilha” microsatélite, independentemente do elemento repetido (CA, TG, ATG, etc.), constituiu um loco genético altamente variável, multialélico, de grande conteúdo informativo. Cada segmento amplificado de tamanho diferente (geralmente de várias dezenas até algumas centenas de pares de bases) representa um alelo diferente do mesmo loco. Apresenta a base genética dos marcadores microsatélites. thumb|direita|Oito tubos de PCR, cada tubo contendo 100μl. A detecção de sequências SSR via PCR, é feita em gel de eletroforese utilizando-se poliacrilamida ou agarose especial de alta resolução, uma vez que é necessário um gel adequado para separação de segmentos que diferem por poucos pares de bases, dependendo do número de nucleotídeos do elemento repetido no microsatélite. A visualização das bandas no gel pode ser feita diretamente com brometo de etídio, nitrato de prata ou através de autoradiografias, ou se utilizar primers marcados com radioisótopos na reação de PCR. Cada loco de microsatélites é analisado individualmente ao se analisar o par de “primers”, constituído especialmente para sua amplificação. Mais do que um loco pode ser analisado de cada vez, quando os alelos de cada loco têm tamanho suficientemente diferentes e migram para zonas separadas no gel. Nesses métodos de genotipagem, denominados “multiplex”, mais do que um par de “primers” específicos é utilizado simultaneamente, na mesma reação de PCR. Locos SSR parecem ser somaticamente estáveis, possuem expressão co-dominante, ou seja, ambos os alelos de um indivíduo heterozigoto são visualizado e são altamente multialelos, numa população onde potencialmente todos os alelos daquele loco podem ser detectados e discriminados.Tran, H. T., Keen, J. D., Kricker, M., Resnick, M. A. & Gordenin, D. A. Hypermutability of homonucleotide runs in mismatch repair and DNA polymerase proofreading yeast mutants. Mol. Cell. Biol. 17, 2859–2865 (1997).thumb|esquerda|Resultado da PCR após ser realizada uma eletroforese em gel de agarose ou de poliacrilamida.
Vantagens de marcadores microsatélites