right|thumb|300px|Imagem gerada por computador de um modelo da estrutura tridimensional da enzima purina nucleósido fosforilase bacteriana. A cinética enzimática estuda as reacções químicas catalisadas pelas enzimas, em especial a velocidade de reacção. O estudo da cinética de uma enzima permite elucidar os pormenores do seu mecanismo catalítico, o seu papel no metabolismo, como é controlada a sua actividade na célula e como pode ser inibida a sua actividade por drogas ou venenos, ou potenciada por outro tipo de moléculas.
Uma enzima (E) é uma proteína que funciona como um catalisador biológico para facilitar e acelerar uma reação química no organismo. Fá-lo ligando-se a outra molécula, o seu substrato (S), sobre o qual a enzima atua para formar o produto desejado. O substrato liga-se ao sítio activo da enzima para formar o complexo enzima-substrato ES, e é transformado no complexo enzima-produto EP, a partir do qual se forma o produto P, através de um estado de transição ES*. Esta série de etapas é conhecida como mecanismo de catálise:
E + S ⇄ ES ⇄ ES* ⇄ EP ⇄ E + P
Este exemplo é o caso mais simples de uma reação com um único substrato e um único produto. Tais casos existem: por exemplo, uma mutase como a fosfoglicomutase catalisa a transferência de um grupo fosfato de uma posição para outra; Esta enzima pertence ao grupo das isomerases, que é um termo mais geral para uma enzima que catalisa qualquer reação de isomerização com um substrato e um produto, como a triose-fosfato isomerase. No entanto, tais enzimas não são muito comuns e são muito superadas em número por enzimas que catalisam reações com dois substratos e dois produtos; entre estas encontram-se, por exemplo, as desidrogenases dependentes de NAD+ como a álcool desidrogenase, que catalisa a oxidação da etanol pelo NAD+. As reações com três ou quatro substratos ou produtos são menos comuns, mas ocorrem. O número de produtos não tem de ser igual ao número de substratos; Por exemplo, a Gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase possui três substratos e dois produtos.
Quando as enzimas se ligam a múltiplos substratos, como a di-hidrofolato redutase (representada à direita), a cinética enzimática pode também mostrar a sequência pela qual os produtos são libertados. Um exemplo de enzimas que se ligam a um único substrato e libertam múltiplos produtos são as proteases, que clivam um substrato proteico em dois produtos polipeptídicos. Outras ligam-se a dois substratos simultaneamente, como a ADN polimerase, que liga o nucleótidos ao ADN. Embora estes mecanismos consistam frequentemente em séries complexas de etapas, existe geralmente uma etapa determinante da velocidade (limitante) da qual depende a cinética global. Esta etapa limitante da velocidade pode ser uma reação química ou uma alteração conformacional na enzima ou nos substratos, como as que estão envolvidas na libertação de produto(s) da enzima.
O conhecimento da estrutura enzimática é útil na interpretação de dados cinéticos. Por exemplo, a estrutura pode sugerir como os substratos e os produtos são ligados durante a catálise; quais as alterações que ocorrem durante a reação; e ainda o papel desempenhado por resíduos específicos de aminoácidos no mecanismo. Algumas enzimas alteram-se significativamente durante o mecanismo; nestes casos, é útil determinar a estrutura da enzima com e sem análogos de substrato ligados que não sofrem a reação enzimática.
Nem todos os catalisadores biológicos são enzimas proteicas, uma vez que também existem catalisadores baseados em RNA, como as ribozimas e os ribossomass, que são essenciais em muitas funções celulares, como o splicing de RNA e a tradução de proteínas. A principal diferença entre as ribozimas e as enzimas é que os catalisadores de RNA são compostos por nucleótidoss, enquanto as enzimas são compostas por aminoácidos. As ribozimas também realizam um conjunto mais limitado de reações, embora os seus mecanismos de reação e cinética possam ser analisados e classificados pelos mesmos métodos.
Introdução Enzimas
As enzimas são macromoléculas com a capacidade de manipular outras moléculas, denominadas substratos. Um substrato pode unir-se ao centro catalítico da enzima que o reconheça e transformar-se num produto ao longo de uma série de passos denominados mecanismo enzimático. Algumas enzimas podem unir vários substratos diferentes e/ou libertar diversos produtos, como é o caso das proteases ao romper uma proteína em dois polipéptidos. Noutros casos, produz-se a união simultânea de dois substratos, como no caso da DNA polimerase, que é capaz de incorporar um nucleótido (substrato 1) a uma cadeia de ADN (substrato 2). Embora todos estes mecanismos sigam usualmente uma complexa série de passos, também podem apresentar um passo limitante que determina a velocidade final de toda a reacção. Este passo limitante pode consistir numa reacção química ou numa mudança de forma da enzima ou do substrato.
O conhecimento adquirido acerca da estrutura das enzimas é útil na interpretação dos dados cinéticos. Por exemplo, a estrutura pode sugerir como permanecem unidos substrato e produto durante a catálise, que mudanças de forma ocorrem durante a reacção, ou mesmo o papel em particular de determinados aminoácidos no mecanismo catalítico. Algumas enzimas modificam a sua forma significativamente durante a reacção, em cujo caso pode ser crucial saber a estrutura molecular da enzima com e sem substrato unido (costumam usar-se análogos que se unem mas não permitem levar a cabo a reacção e mantêm a enzima permanentemente na forma de substrato unido).
Os mecanismos enzimáticos podem ser divididos em mecanismos de substrato único e mecanismos de múltiplos substratos. Os estudos cinéticos com enzimas que apenas unem um substrato, como a triose-fosfato isomerase, visam a medir a afinidade com a que se une o substrato e a velocidade com que o transforma em produto. Por outro lado, ao estudar una enzima que une vários substratos, como a di-hidrofolato redutase, a cinética enzimática pode mostrar também a ordem pela qual se unem os substratos e se libertam os produtos.
Nem todas as catálises biológicas são efectuadas por enzimas proteicas. Existem moléculas catalíticas baseadas no ARN, como as ribozimas e os ribossomas, essenciais para o splicing alternativo e a tradução do ARNm, respectivamente. A principal diferença entre as ribozimas e os ribossomas radica no limitado número de reacções que as primeiras podem efectuar, embora os seus mecanismos de reacção e as suas cinéticas possam ser estudados e classificados pelos mesmos métodos.
Princípios gerais thumb|300px|right|A velocidade de reacção aumenta com a concentração do substrato, eventualmente ficando a enzima saturada a altas concentrações de substrato. A reacção catalisada por uma enzima utiliza a mesma quantidade de substrato e gera a mesma quantidade de produto que uma reação não catalisada. Tal como ocorre noutros tipos de catálise, as enzimas não alteram em absoluto o equilíbrio da reacção entre substrato e produto.Ebbing, D.D. General chemistry (4th ed.) Houghton Mifflin Co. 1993, Ao contrário do que acontece noutras reacções químicas, as enzimas saturam-se. Isto significa que com uma maior quantidade de substrato, mais centros catalíticos estarão ocupados, o que incrementará a eficiência da reacção, até ao momento em que todos os sítios possíveis estejam ocupados. Nesse momento ter-se-á alcançado o ponto de saturação da enzima e, embora se adicione mais substrato, não aumentará mais a eficiência.
As duas propriedades cinéticas mais importantes de uma enzima são: o tempo que demora a saturar-se com um substrato em particular e o seu ponto máximo de saturação. O conhecimento destas propriedades torna possível formular hipóteses sobre o comportamento de uma enzima no ambiente celular e prever como responderá frente a mudanças nessas condições.
Ensaios enzimáticos Ensaios enzimáticos são procedimentos laboratoriais que medem a velocidade de reacções enzimáticas. Uma vez que as enzimas não são consumidas pelas reacções que catalisam, nos ensaios seguem-se habitualmente mudanças na concentração de substratos ou produtos para medir a taxa de reacção. Há vários métodos de medida: os ensaios espectrofotométricos medem a mudança de absorbância da luz entre produtos e reagentes; ensaios radiométricos envolvem a incorporação ou libertação de radioactividade para medir a quantidade de produto que surge ao longo do tempo. Os ensaios espectrofotométricos são mais convenientes pois permitem a medição contínua da velocidade de reacção. Embora os ensaios radiométricos exijam a remoção e contagem de amostras (ou seja, são ensaios descontínuos), são habitualmente de grande sensibilidade e podem medir vários níveis da actividade enzimática.Eisenthal R. Danson M.J. (Eds), Enzyme Assays: A Practical Approach. Oxford University Press (2002) Uma abordagem análoga é usada na espectrometria de massa para aferir a incorporação ou libertação de isótopos estáveis à medida que o substrato é convertido em produto.
Os ensaios enzimáticos mais sensíveis usam lasers focados por um microscópio para observar mudanças em moléculas enzimáticas individuais à medida que decorre a reacção. Estas medidas usam geralmente mudanças na fluorescência de cofactores durante o mecanismo de reacção, ou fluoróforos adicionados a locais específicos da proteína que registam movimentos que ocorrem durante a catálise.Xie XS, Lu HP. Single-molecule enzymology. J Biol Chem. 1999 Jun 4;274(23):15967-70. PMID 10347141 Estes estudos fornecem um novo panorama sobre a cinética e dinâmica de moléculas individuais, em oposição à tradicional cinética enzimática, que observa o comportamento médio de populações com milhões de moléculas enzimáticas.
Reacções mono-substrato Entre as enzimas com mecanismos mono-substrato incluem-se as isomerases como a triose-fosfato isomerase ou bisfosfoglicerato mutase, liases intramoleculares como a adenilato ciclase e a ribozima, uma liase de RNA.Hammann C, Lilley DM. Folding and activity of the hammerhead ribozyme. Chembiochem. 2002 Aug 2;3(8):690–700. PMID 11779233 Porém, algumas enzimas que apenas têm um substrato não se agrupam nesta categoria de mecanismos. A catalase é um exemplo, pois reage com uma molécula de substrato de peróxido de hidrogénio, oxida-se e é então reduzida por uma segunda molécula de substrato. Embora um único substrato esteja envolvido, a existência de um intermediário que é uma enzima modificada significa que o mecanismo de catálise é um mecanismo ping-pong (tipo de mecanismo discutido mais abaixo).
Cinética de Michaelis–Menten thumb|300px|Curva de saturação para uma enzima mostrando a relação entre a concentração do substrato (abcissas) e a velocidade de reacção (ordenadas). As reacções catalisadas por enzimas são saturáveis, e a sua velocidade de catálise não indica uma resposta linear face ao aumento de substrato. Se a velocidade inicial da reacção é medida sobre uma escala de concentrações de substrato (denotada como [S]), a velocidade de reacção (v) aumenta com o acréscimo de [S]. Todavia, à medida que [S] aumenta, a enzima satura-se e a velocidade atinge o valor máximo Vmax.
No modelo da cinética de Michaelis-Menten de uma reacção mono-substrato existe uma reacção bimolecular inicial entre a enzima E e o substrato S para formar o complexo ES. Embora o mecanismo enzimático para a reacção unimolecular possa ser bastante complexo, há tipicamente um passo na determinação da velocidade que permite que se modele o mecanismo como um passo catalítico simples de velocidade constante k2.
(Eq. 1).
k2 também é designado como kcat ou turnover, o valor máximo de reacções enzimáticas catalisadas por segundo.