Polimorfismo de conformação de filamento único ou polimorfismo de conformação de fita simples (SSCP, do inglês Single Strand Conformation Polymorphism) é definida como uma técnica de diferenciação de filamentos únicos de DNA de comprimentos idênticos como induzidos por diferenças nas sequências sob certas condições experimentais. Esta propriedade permite distinguir as seqüências por meio de eletroforese em gel, que separa as diferentes conformações.
Aplicações
O SSCP é um método destinado a realizar a triagem de mutações que permite a detecção de alterações na mobilidade eletroforética de fitas simples dos ácidos nucleicos em condições não-desnaturantesOrita M, Iwahana H, Kanazawa H, Hayashi K, Sekiya T. Detection of polymorphisms of human DNA by gel electrophoresis as single-strand conformation polymorphisms. Proc Natl Acad Sci USA 1989; 86: 2766-70.. As fitas simples de ácidos nucleicos formam estruturas secundárias em solução que dependem da composição e do sequenciamento das bases e do comprimento da fita simples. Tais estruturas secundárias eram obtidas inicialmente, por meio de desnaturação do produto de amplificação antes do início da eletroforeseLEE, D. -H.; ZO, Y. -G.; KIM, S. -J. Nonradioactive method to study genetic profiles of natural bacterial communities by PCR-single strand conformation polymorphism. Applied and Environmental Microbiology, Washington, v. 62, n. 9, p. 3112-3120, 1996..
A mudança em uma base na seqüência do ácido nucléico amplificado pela técnica de PCR pode ser detectada pela técnica SSCP. Os perfis de SSCP podem ser detectados por autorradiografia pel marcação dos produtos resultantes da PCR com substâncias marcadoras radiativas. Hoje são utilizados sistemas de detecção pela coloração dos géis de eletroforese com a adição de sal nitrato de prata.
A técnica SSCP foi inicialmente descrita para a análise de DNA, porém, a análise de RNA também é realizávelSarkar G, Yoon HS, Sommer SS. Screening for mutations by RNA single-strand conformation polymorphism (rSSCP): comparison with DNA-SSCP. Nucleic Acids Res 1992; 20: 871-8.. Distintas estruturas secundárias são formadas com maior freqüência pelo RNA do que por moléculas de DNA e fragmentos maiores passam a poderem ser analisados. As mutações detectadas pela técnica SSCP devem ser posteriormente confirmadas por técnica de sequenciamento de DNASanger F, Nicklen S, Coulson AR. DNA sequencing with chainterminating inhibitors. Proc Natl Acad Sci U S A 1977; 74: 5463-7.. Além destes procedimentos, em várias aplicações, sistemas de análise por eletroforese em gel de dimensões menores são utilizados em substituição aos sistemas padronizados para o sequenciamento de DNAKurvinen K, Hietanen S, Syrjanen K, Syrjanen S. Rapid and effective detection of mutations in the p53 gene using nonradioactive single-strand conformation polymorphism (SSCP) technique applied on PhastSystem. J Virol Methods 1995; 51: 43-53..
É conhecido que a sensibilidade de detecção de mutações para a técnica de SSCP é maior quando os tamanhos dos produtos da PCR são de 150 a 200 pbSheffield VC, Beck JS, Kwitek AE, Sandstrom DW, Stone EM. The sensitivity of single-strand conformation polymorphism analysis for the detection of single base substitutions. Genomics 1993; 16: 325-32.. O número de mutações que pode ser detectado diminui para fragmentos maiores submetidos ao método de análise. Triagens de mutações de produtos maiores são obtidas utilizando-se RNA-SSCP, com menor prejuízo para o método quanto a sua sensibilidade.
Nesta técnica a eletroforese é realizada em gel de poliacrilamida não-desnaturante. Dependendo da concentração da poliacrilamida, do tamanho do fragmento analisado e da presença de glicerol no gel, o tempo adequado de separação varia entre 2 até 6 horas. A resolução do método é maior em sistemas de géis desenvolvidos especialmente para a técnica disponíveis no comércioBroly F, Marez D, Sabbagh N, Legrand M, Millecamps S, Lo Guidice JM et al. An efficient strategy for detection of known and new mutations of the CYP2D6 gene using single strand conformation polymorphism analysis. Pharmacogenetics 1995; 5: 373-84.. Sob diferentes condições a análise um fragmento pode ter aumentado seu índice de detecção de mutações, sendo que as condições ideais devem ser determinadas por métodos empíricos. Em condições em que a execução da eletroforese tenha em seu sistema pelo menos duas temperaturas e dois tampões de eletrodos somada a dependência do tamanho do produto da PCR (que deve ser menor que 200 pb) até 80 a 90% de mutações permitem ser detectadas pela SSCPSalazar LA, Hirata MH, Hirata RD. Increasing the sensitivity of single-strand conformation polymorphism analysis of the LDLR gene mutations in brazilian patients with familial hypercholesterolemia. Clin Chem Lab Med 2002; 40: 441-5..
SSCP para bactérias
Schwieger & Tebbe (1998)SCHWIEGER, F.; TEBBE, C. C. Effect of field inoculation with Sinorhizobium meliloti L33 on the composition of bacterial communities rhizospheres of a target plant (Chenopodium album)-linking of 16S rRNA gene-based single-strand conformation polymorphism community profiles to the diversity of cultivated bacteria. Applied and Environmental Microbiology, Washington, v. 66, n. 8, p. 3556-3565, 2000., procurando de evitar o reanelamento das fitas homólogas, que ocorrem após desnaturação inicial com bastante frequência, adaptaram a técnica de SSCP aumentando o possibilidade do uso desta técnica de análise para bactérias.
Nesta aplicação, utiliza-se um iniciador contendo o terminal 5´ marcado por fosforilação e durante a etapa PCR, tal iniciador é incorporado a uma das fitas do DNA, que submetido a um tratamento como se fosse uma enzima do exonuclease que reconhece o iniciador fosforilado, propicia a digestão preferencial da fita marcada. A fita simples apresenta sua mobilidade eletroforética em gel de poliacrilamida dependente da conformação que ela assume conforme sua seqüência de bases durante o processo de eletroforese. Os produtos de amplificação que interessa à análise da população de bactérias podem ser depois clonados e sequenciados (Torsvik et al., 1990TORSVIK, V.; GOSKØYR, J.; DAAE, F. L. High diversity in DNA of soil bacteria. Applied and Environmental Microbiology, Washington v. 56, n. 2, p. 782-787, 1990.; Nüsslein & Tiedje, 1999NÜSSLEIN, K.; TIEDJE, J. Soil bacteria community shifts correlated with changes from forest to pasture vegetation in tropical soil. Applied and Environmental Microbiology, Washington, v. 65, n. 8, p. 3622-3626, 1999.).
O método SSCP foi utilizado para monitorar a diversidade bacteriana durante diferentes estágios de compostagem (Peters et al., 2000PETERS, S.; KOSCHINSKY, S.; SCHWIEGER, F.; TEBBE, C. C. Succession of microbial communities during hot composting as detected by PCR-Single-Strand-Conformation Polymorphism-based genetics profiles of small-subunit rRNA genes. Applied and Environmental Microbiology, Washington, v. 66, n. 3, p. 930-936, 2000.) e chegaram a conclusão que esta técnica apresenta potencialidade para analisar populações de bactérias e sua variabilidade.
Schwieger e Tebbe por meio do método SSCP conseguiram analisar os perfis genéticos da região 16S do rDNA e obtiveram a detecção de alto grau de especificidade de bactérias da rizosfera.SCHWIEGER, F.; TEBBE, C. C. Effect of field inoculation with Sinorhizobium meliloti L33 on the composition of bacterial communities rhizospheres of a target plant (Chenopodium album)- linking of 16S rRNA gene-based single-strand conformation polymorphism community profiles to the diversity of cultivated bacteria. Applied and Environmental Microbiology, Washington, v. 66, n. 8, p. 3556-3565, 2000. Tal metodologia apresentou potencialidade no monitoramento de bactérias introduzidas como o inoculantes Sinorhizobium meliloti em Medicago sativa e Chenopodium album. Além destas aplicações, SSCP é utilizada para a comparação entrebactérias presentes em plantas transgênicas e não-transgênicas (Schamalenberg & Tebbe, 2002)Gustavo Ribeiro Xavier, Jerri Édson Zilli, Norma Gouvêa Rumjanek; Estudo da comunidade microbiana do solo através de clonagem, eletroforese em géis desnaturantes (DGGE/TGGE) e conformação de fita simples do DNA (SSCP) Embrapa Documentos; Setembro 2004; ISSN 1517-8498 - www.cnpab.embrapa.br
Assim, a técnica de SSCP é aplicada na análise de comunidades microbianas em solos, conjuntamente com técnicas de géis desnaturantes, como DGGE e TGGE.
Referências
Ligações externas
Mario Hiroyuki Hirata, Vladimir Tavares, Rosario Dominguez Crespo Hirata; DA BIOLOGIA MOLECULAR À MEDICINA: MÉTODOS COMUMENTE UTILIZADOS EM FARMACOGENÉTICA; Medicina, Ribeirão Preto, 39 (4): 522-34, out./dez. 2006 - www.fmrp.usp.br
Categoria:Biologia molecular