A cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE; em inglês: High performance liquid chromatography, HPLC) é um método de separação de compostos químicos em solução, a qual é utilizada na química analítica para identificar e quantificar cada componente em uma mistura. Esta técnica consiste no bombeamento de um solvente líquido pressurizado contendo uma mistura que passa através de uma coluna preenchida com algum material sorvente. Cada componente da amostra interage de forma diferenciada com o material sorvente, gerando diferentes velocidades para cada componente e levando à separação conforme eles percorrem a coluna.
A cromatografia líquida foi definida no início de 1900 pelo botânico russo Mikhail S. Tswett. Considerado o pai da cromatografia, Tswett publicou o primeiro artigo de cromatografia líquida, no qual ele descreveu a separação de compostos (pigmentos de folhas) extraídos de plantas, utilizando solvente em uma coluna empacotada com partículas de carbonato de cálcio. No período entre 1906 e 1952 houve alguns avanços importantes, como por exemplo o surgimento da técnica de cromatografia planar, onde um papel é usado como suporte. No entanto, em 1950 foi introduzido como alternativa a camada fina de sílica, que posteriormente ficou conhecida como cromatografia de camada delgada (CCD). O avanço da cromatografia em coluna foi por volta de 1940 com Martin e Synge, vencedores do prêmio Nobel, descreveram um modelo para a cromatografia líquida-líquida (ou de partição). A cromatografia líquida moderna foi desenvolvida a partir de 1970, se diferenciando da cromatografia em coluna (atualmente denominada cromatografia líquida clássica) e se aperfeiçoando até chegar no que atualmente é conhecido como cromatografia líquida de alta eficiência.
O HPLC é capaz de separar uma grande quantidade de compostos em diversos tipos de amostra no espaço de tempo de alguns minutos, exibindo alta resolução e detectabilidade.
Princípios gerais da cromatografia O princípio básico da cromatografia é a separação de misturas, no qual os componentes a serem separados são distribuídos entre duas fases, uma fase estacionária e uma fase móvel, como mostrado na figura 1.
Entre os diferentes tipos de cromatografia, a cromatografia líquida de alta eficiência tem sido amplamente utilizada como uma ferramenta na bioquímica e análise de separação, identificação e quantificação de compostos ativos. Um esquema simplificado de CLAE está descrito na figura 2.
Os principais componentes da cromatografia líquida são: a bomba, que movimenta a fase móvel e a amostra através da coluna; uma coluna, que contêm a fase estacionária, geralmente formada por partículas de sílica, porosas, esféricas e diâmetro em torno de 35 μm, e um detector que mostra os tempos de retenção das moléculas, sendo que o tempo de retenção varia de acordo com as interações da amostra com as fases estacionária e móvel.
Parâmetros cromatográficos Tempo de retenção O tempo de retenção () é o tempo gasto por um componente desde a sua injeção até a sua detecção na saída do sistema. O tempo de retenção engloba todo o tempo que um componente fica no sistema cromatográfico, seja diluído na fase móvel, seja retido na fase estacionária. A Figura 3 ilustra um cromatograma típico. O tempo indicado no primeiro sinal do cromatograma indica o tempo gasto pelas moléculas da fase móvel para atravessar a coluna e atingir o detector. Esse tempo é chamado de tempo morto (), e normalmente é determinado por algum composto ou impureza presente na mistura em análise que não é retido pela fase estacionária. Para a determinação dos tempos de retenção corrigidos () é necessário conhecer o tempo morto, uma vez que a correção é feita simplesmente descontando o seu valor do valor do tempo de retenção.
Fator de retenção ou capacidade O fator de retenção é a medida da capacidade da coluna em reter um componente da amostra, ou seja, é a medida de retenção na fase estacionária. O fator de retenção é dada pela equação abaixo:
onde,
é o fator de retenção; é o tempo de retenção; é o tempo morto.
Coeficiente de separação ou seletividade O coeficiente de separação () é calculado pela razão entre os fatores de capacidade () de dois compostos que resultem em picos adjacentes no cromatograma. Por definição a seletividade é sempre maior que 1, e pode ser calculada pela equação abaixo:
onde,
é o fator de capacidade; é o fator de capacidade do composto B; é o fator de capacidade do composto A; é o tempo de retenção do composto B; é o tempo de retenção do composto A; é o tempo morto.
Eficiência Para estimar a eficiência de uma coluna cromatográfica é possível usar dois termos que estão relacionados entre si: o número de pratos teóricos () e a altura equivalente a um prato teórico (), que se relacionam pela equação a seguir:
onde,
L é o comprimento da coluna cromatográfica.
A altura equivalente de um prato teórico é utilizada para comparar a eficiência entre colunas de diferentes comprimentos. Quanto menor a altura do prato teórico, maior será a eficiência da coluna.
Resolução Para determinar a resolução entre duas bandas, consideram-se as larguras das bandas () assim como seus respectivos tempos de retenção, de acordo com a equação a seguir:
Embora os parâmetros citados acima sejam importantes, a separação de substâncias não depende somente deles. O alargamento das bandas, assim como a eficiência e a seletividade influenciam em uma boa resolução. Pode-se resumir a resolução como um relação complexa entre a eficiência (), seletividade () e a retenção ():
Alargamento de banda Uma baixa eficiência de separação pode ser explicada pelo alargamento da banda de um composto. Há muitas razões que contribuem para o alargamento da banda, os fatores intrínsecos podem ser explicados pela equação de van Deemter.
onde,
A é a difusão turbulenta (difusão de eddy); B é a difusão longitudinal; C é o desequilíbrio local ou resistência à transferência de massa.
A equação de van Deemter é a equação fundamental para a descrição da performance de uma coluna, e mostra a relação da altura equivalente de um prato teórico, com a velocidade da fase móvel, .
A difusão por turbilhonamento (A) é consequência dos diversos caminhos que as moléculas da amostra podem percorrer através da coluna. A difusão de três moléculas são mostradas na figura 4. Todas as três começam na mesma posição inicial, mas elas tendem a seguir caminhos diferentes ao longo da coluna empacotada. Devido ao fluxo constante da fase móvel, as três moléculas chegam com tempos diferentes e consequentemente se separando. A molécula que pegou o caminho direto (molécula 3) termina na parte da frente da banda, por exemplo. Esse termo da equação pode ser minimizado usando-se colunas de tamanho reduzido, com diâmetros internos menores, com enchimentos eficientes e partículas uniformes.
O termo B, difusão longitudinal, se refere a difusão do soluto na fase móvel. Se a amostra permanece por um determinado período dentro da coluna, ela tenderá a se difundir em todas as direções — da mesma forma como um cubo de açúcar ao se dissolver no café sem agitar (figura 5). Uma forma de minimizar este efeito é empregando-se altas velocidades lineares de fase móvel.
A resistência à transferência de massa, termo C, se refere ao processo de movimentação da amostra dentro e fora da fase estacionária e da fase móvel. Conforme a transferência de massas for mais rápida, melhor é a eficiência. Este processo pode ser melhorado pelo uso de camada mais finas de fase estacionárias, partículas menores, fases móveis de baixa viscosidade, assim como altas temperaturas.
Detectores de HPLC O detector cromatográfico é um dispositivo conectado logo após a coluna cromatográfica que quando em contato com os analitos presentes no eluente, emite sinais elétricos que são registrados na forma de picos. Através deste registro, podem-se obter dados qualitativos e quantitativos sobre os analitos presentes na amostra.
Existem vários tipos de detectores, sendo que a escolha dependerá fortemente das características químicas ou físicas das espécies a serem detectadas. Os detectores de HPLC devem possuir várias características, dentre as quais pode se mencionar: alta sensibilidade, seletividade, linearidade (correspondente a aumento da concentração do analito), pouco sensível às variações de temperatura e fluxo, preciso e com reprodutibilidade.
O primeiro detector considerado na cromatografia líquida foi o olho humano, que através dos experimentos clássicos utilizando uma coluna de vidro, permitiu-se separar os compostos de colorações diferentes. Os primeiros detectores comerciais utilizados em um sistema de HPLC foram os detectores de índice de refração e de condutividade elétrica, entretanto, com a introdução do detector de ultra-violeta ampliaram-se as possibilidades de uso da cromatografia líquida na química analítica.
Detectores de UV-visível São os detectores mais utilizados em HPLC, pois apresentam o custo mais baixo, aceitam o uso de gradiente e geralmente não são afetados por pequenas mudanças de fluxo e temperatura. Consiste em um espectrofotômetro que mede a absorção de luz dos compostos, em certo comprimento de onda, compreendido entre as regiões visível e ultravioleta do espectro eletromagnético.
O princípio da detecção por UV-vis pode ser definido através da concentração do analito relacionada à fração da luz transmitida pela célula do detector pela lei de Beer-Lambert, onde:
A = Log (I0 / I ) = b.c. ε
Onde:
A - Absorbância ;
I0 - Intensidade da incidência de luz;
ε - Absortividade molar da substância;
b -Comprimento do percurso da célula do detector (cm) ;
c- Concentração da amostra em mols/L.
A absorvidade molar para um grande número de compostos pode ser encontrado na literatura. A absorbância geralmente é proporcional à concentração da amostra.
A configuração de um detector de UV-vis de comprimento de onda fixo pode ser representada pela seguinte figura 1: thumb|figura 1 - detector de UV-vis de comprimento de onda fixo
A lâmpada, também chamada de fonte luminosa, pode ser de tungstênio, deutério, mercúrio, zinco, cádmio, xenônio ou outros, que será aplicada de acordo com a configuração do detector e comprimento de onda desejado.
As configurações mais comuns dos detectores de UV-vis são: Detector de comprimento de onda fixo, detector de comprimento de onda variável e detector de rede de diodos (diode array). Este último permite determinar os espectros das substâncias presentes da amostra no eluente com diferentes comprimentos de onda durante a análise cromatográfica.
A detecção por UV-vis é geralmente aplicada em compostos cujas moléculas possuam algumas características para a absorção na região de UV-vis. Abaixo segue tabela com os grupos principais que compõe os analitos analisados: Tabela 1 - PRINCIPAIS GRUPOS QUE ABSORVEM NA REGIÃO DE UV-VisLigação dupla adjacente a um átomo com um par de elétrons livresBromo, iodo ou enxofreGrupo carbonila (C=O )Grupo nitro ( NO2 ) Duas ligações duplas conjugadas Anel aromáticoÍons inorgânicos: Brometo,iodeto, nitrito, nitrato A intensidade da absorção da molécula dependerá dos grupos presentes e da influência que eles podem exercer sobre os outros grupos presentes.
Detector de Fluorescência